大(da)鼠(shu)游離(li)氨基酸(FAA）ELISA試劑盒(he)課題研究(jiu)

大鼠游離(li)氨基(ji)酸(FAA）ELISA試劑盒(he)實驗原(yuan)理

大鼠游(you)離(li)氨基(ji)酸(FAA）ELISA試(shi)劑盒采用雙抗(kang)體(ti)一步夾心法(fa)酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先(xian)包(bao)被大鼠游(you)離氨(an)基酸(FAA）捕獲(huo)抗體的包被(bei)微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記(ji)的檢(jian)測(ce)抗體(ti)，經過(guo)溫育并(bing)徹di洗滌。用底物TMB顯(xian)色，TMB在過氧化物酶的(de)催化下轉(zhuan)化成藍色，并在酸的(de)作(zuo)用(yong)下轉(zhuan)化成最終的(de)黃色。顏色的(de)深淺(qian)和樣品中(zhong)的(de)大鼠(shu)游(you)離氨基(ji)酸(FAA）呈正相關(guan)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(du)（OD 值），計算樣品濃度(du)。

樣本(ben)處(chu)理及要求

1.  血(xue)清：將收(shou)集(ji)于血清分離管的全血標本在室溫放(fang)置2小(xiao)時或(huo)4℃過(guo)夜，然(ran)后1000×g離心20 分鐘，取上清(qing)即(ji)可，或(huo)將上清(qing)置(zhi)于-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但應(ying)避免反復(fu)凍融。
2.  血(xue)漿：用EDTA或(huo)肝素作為抗(kang)凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取(qu)上(shang)清即可檢測(ce)，或(huo)將上(shang)清置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避(bi)免(mian)反復凍融。
3. 組織勻(yun)漿：用預冷(leng)的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組(zu)織，去除殘(can)留血液(ye)（勻(yun)漿中裂(lie)解的(de)紅細(xi)胞會影響測量(liang)結果），稱(cheng)重后(hou)將(jiang)組(zu)織剪(jian)碎(sui)。將(jiang)剪(jian)碎(sui)的(de)組(zu)織與對應(ying)體積(ji)的(de)PBS（一(yi)般按(an)1:9的(de)重量(liang)體積(ji)比(bi)，比(bi)如1g的(de)組(zu)織樣品對應(ying)9mL的(de)PBS，具體體積(ji)可(ke)根(gen)據實(shi)驗需要適當調整，并做好記錄。推(tui)薦在PBS中加入(ru)蛋白酶抑制劑）加入(ru)玻璃勻(yun)漿器中，于(yu)冰上(shang)充分研磨。為(wei)了(le)進一(yi)步裂(lie)解組(zu)織細(xi)胞，可(ke)以對勻(yun)漿液(ye)進行超聲破碎(sui)，或反復凍融。最后(hou)將(jiang)勻(yun)漿液(ye)于(yu)5000×g離心5~10分鐘，取(qu)上(shang)清檢測。

4. 細胞培養物(wu)上清或(huo)其它生物(wu)標本：請1000×g離心20分鐘，取上(shang)(shang)清即可檢測，或將上(shang)(shang)清置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但應(ying)避免反復凍(dong)融。

注：標本(ben)溶(rong)血會影響最后(hou)檢測結果(guo)，因(yin)此溶(rong)血標本(ben)不宜(yi)進行此項檢測。

需要而未提(ti)供的試劑盒器材

1.酶標儀（450nm）

2.高精(jing)度加(jia)樣(yang)器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫(wen)箱

4.蒸餾水或去(qu)離(li)子水

備注(zhu)：

1、標準(zhun)品濃度依次為：詳見說明書(shu)；

2、經過大量正常標(biao)(biao)本(ben)檢驗(yan)，標(biao)(biao)本(ben)的正常濃度值均(jun)在試劑盒提(ti)供的檢測范(fan)圍內，實驗(yan)過程中直接取50μL樣(yang)本(ben)上(shang)樣(yang)即可。當(dang)有(you)部分樣(yang)本(ben)值超(chao)過最大標(biao)準品濃度時，可用樣(yang)本(ben)稀釋(shi)液將標(biao)本(ben)進行(xing)適當(dang)稀釋(shi)后再進行(xing)實驗。

注意(yi)事項

1、嚴格(ge)按(an)照規定的時(shi)間和溫(wen)(wen)度進(jin)行(xing)溫(wen)(wen)育(yu)以保證準確結果(guo)。所有試劑都必須在使(shi)用前達到室溫(wen)(wen)20-25℃。使用(yong)后立即冷藏保(bao)存試劑。

2、洗板(ban)不正確(que)(que)可以導致不準確(que)(que)的結(jie)果。在加入底(di)物前確(que)(que)保(bao)盡量(liang)吸干孔內(nei)液體(ti)。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3、消除板底殘留(liu)的液(ye)體和手指印，否則影響OD值(zhi)。

4、底(di)物(wu)顯(xian)色液(ye)應呈無色或(huo)很淺(qian)的(de)顏(yan)色，已經變藍的(de)底(di)物(wu)液(ye)不能使用(yong)。

5、避免試劑和(he)標本(ben)的交叉污染以免造(zao)成錯誤結果。

6、在儲存和溫(wen)育時(shi)避免強光直接照射。

7、平衡至室溫后(hou)再打開密封袋(dai)以防水滴凝聚在冷板條上。

8、任何反(fan)應(ying)試(shi)劑(ji)不能(neng)接(jie)觸(chu)漂(piao)(piao)白溶(rong)劑(ji)或漂(piao)(piao)白溶(rong)劑(ji)所散發(fa)的(de)強烈氣體(ti)。任何漂(piao)(piao)白成分都(dou)會破(po)壞試(shi)劑(ji)盒中反(fan)應(ying)試(shi)劑(ji)的(de)生物(wu)活性。

9、不能使用過(guo)期產品。

10、如果可能傳播疾病(bing)，所有的(de)樣品都(dou)應管(guan)理好，按照(zhao)規定的(de)程序處理樣品和檢測裝(zhuang)置。

試劑準(zhun)備

試劑(ji)盒從冷藏(zang)環境中取出應在(zai)室溫平衡后方(fang)可(ke)使(shi)用(yong)。

20×洗(xi)滌緩沖液的稀釋(shi)：蒸餾(liu)水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾(liu)水(shui)。

操(cao)作步驟

1.從(cong)室溫平衡20min后的鋁(lv)箔袋中取(qu)出(chu)所需板條(tiao)，剩余板條(tiao)用自封(feng)袋密封(feng)放回(hui)4℃。

2. 設置標準(zhun)(zhun)品孔(kong)和樣(yang)本孔(kong)，標準(zhun)(zhun)品孔(kong)各加不同濃度的(de)標準(zhun)(zhun)品50μL；

3.樣本孔中加入(ru)待(dai)測樣本50μL；空(kong)白孔不加。

4. 除(chu)空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(mei)（HRP）標記(ji)的檢(jian)測(ce)抗(kang)體(ti)100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋(guo)或(huo)恒(heng)溫(wen)箱溫(wen)育(yu)60min。

5. 棄去液(ye)(ye)體，吸水紙上(shang)拍干，每孔(kong)加(jia)滿洗滌液(ye)(ye)（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上(shang)拍干，如此重(zhong)復洗板5次（也可用洗板(ban)機(ji)洗板(ban)）。

6.每孔加入底物(wu)A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nei)，在450nm波長(chang)處測定(ding)各孔的OD值。

實驗結(jie)果計算

以所(suo)測標準(zhun)品的OD值為橫(heng)坐標，標準品(pin)的濃(nong)度值(zhi)為縱坐標(biao)，在坐標(biao)紙上或用(yong)相關軟件(jian)繪(hui)制(zhi)標準曲線，并得到直線回歸方程，將(jiang)樣品的OD值代入方(fang)程(cheng)，計(ji)算出樣品的濃度(du)。

試劑盒性(xing)能

1、檢測范圍：詳(xiang)見產品說明書。

2、靈敏(min)度：最di檢測濃度小于0.1 U/L。

3、特異性：不與其它可溶性結(jie)構類似物交叉反應。

4、重復性(xing)：板內(nei)變異系數小于(yu)10% ，板間變異系數小于15% 。