大鼠胱抑(yi)素(Cys）ELISA試(shi)劑盒產品說明(ming)

大鼠胱抑素(Cys）ELISA試劑盒(he)實(shi)驗(yan)原理(li)

大(da)鼠(shu)胱抑素(Cys）ELISA試劑盒采用雙抗體一步夾(jia)心法酶聯免疫(yi)吸附試驗（ELISA）。往預先包(bao)被大(da)鼠胱(guang)抑素(Cys）捕獲抗體的包被微孔中，依次加(jia)入(ru)標本、標準品、HRP標記的(de)檢測抗體(ti)，經過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色(se)，TMB在(zai)過氧化(hua)物酶的催化(hua)下(xia)轉化(hua)成(cheng)藍(lan)色(se)，并在(zai)酸(suan)的作用下(xia)轉化(hua)成(cheng)最終(zhong)的黃色(se)。顏色(se)的深淺和樣品中的大鼠胱抑素(Cys）呈正(zheng)相關。用酶(mei)標儀在450nm 波長下測定吸光度(du)（OD 值），計算樣品濃度(du)。

樣(yang)本處理(li)及要求

1.  血(xue)清：將(jiang)收集于血清(qing)分離(li)管的全血標(biao)本在室(shi)溫放置2小(xiao)時(shi)或(huo)(huo)4℃過(guo)夜(ye)，然后1000×g離心20 分鐘，取(qu)上(shang)清即可，或(huo)(huo)將上(shang)清置于(yu)-20℃或(huo)(huo)-80℃保存，但應避免反復凍(dong)融。
2.  血漿：用EDTA或(huo)肝(gan)素(su)作為抗凝劑采(cai)集標本，并將(jiang)標本在采(cai)集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心(xin)15分鐘，取(qu)上清即可檢測，或(huo)將(jiang)上清置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應(ying)避免反復凍融。
3. 組織勻漿：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液(ye)(ye)（勻漿(jiang)(jiang)中裂解的(de)紅(hong)細胞會影響測量(liang)結果），稱重(zhong)后(hou)將組織剪碎。將剪碎的(de)組織與對(dui)應體(ti)積的(de)PBS（一般按1:9的(de)重(zhong)量(liang)體(ti)積比，比如1g的(de)組織樣品對(dui)應9mL的(de)PBS，具體(ti)體(ti)積可根據(ju)實驗(yan)需要(yao)適當調(diao)整，并(bing)做好記錄。推(tui)薦在(zai)PBS中加(jia)入蛋白(bai)酶抑制劑）加(jia)入玻璃勻漿(jiang)(jiang)器(qi)中，于冰(bing)上(shang)充分研磨。為了進一步(bu)裂解組織細胞，可以(yi)對(dui)勻漿(jiang)(jiang)液(ye)(ye)進行超聲破碎，或反復凍融(rong)。最后(hou)將勻漿(jiang)(jiang)液(ye)(ye)于5000×g離(li)心5~10分鐘，取上(shang)清檢(jian)測。

4. 細胞培養物上清或其(qi)它(ta)生物標本：請1000×g離心20分鐘，取(qu)上(shang)清即可檢測，或將上(shang)清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍(dong)融。

注：標本溶(rong)血會(hui)影響最后檢(jian)測結果(guo)，因此溶(rong)血標本不宜(yi)進行此項(xiang)檢(jian)測。

需要(yao)而未提供的試(shi)劑盒器材

1.酶標(biao)儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或(huo)去(qu)離子(zi)水

備注：

1、標準品濃(nong)度依(yi)次為：詳見說明(ming)書；

2、經過大量正常(chang)標(biao)本檢驗(yan)，標(biao)本的(de)正常(chang)濃度值均在(zai)試(shi)劑盒提(ti)供的(de)檢測范圍內，實(shi)驗(yan)過程(cheng)中直接取50μL樣本(ben)(ben)上(shang)樣即可。當有部分樣本(ben)(ben)值(zhi)超過最大(da)標準品濃度時，可用樣本(ben)(ben)稀釋(shi)液將標本(ben)(ben)進行適當稀釋(shi)后再進行實(shi)驗。

注(zhu)意事項

1、嚴格按照規(gui)定的(de)時(shi)間和溫(wen)度進行(xing)溫(wen)育以保證準確(que)結果。所(suo)有試劑都必須在使用(yong)前(qian)達到室(shi)溫(wen)20-25℃。使用后立即冷藏(zang)保存試劑。

2、洗板(ban)不正確可以導致不準確的結果(guo)。在加入底物前確保盡量吸(xi)干孔內液體(ti)。溫育(yu)過程中不要(yao)讓微孔干燥掉。

3、消除板底殘留的液體和手指印(yin)，否則影響OD值(zhi)。

4、底物顯色液應呈(cheng)無(wu)色或很淺的(de)顏(yan)色，已(yi)經變藍的(de)底物液不能使用。

5、避(bi)免(mian)試(shi)劑和標本的交(jiao)叉污染以免(mian)造成錯誤結(jie)果。

6、在(zai)儲(chu)存和溫育時避免強光直接照射。

7、平衡至室溫后(hou)再打開密封袋以防水滴凝(ning)聚(ju)在冷板條(tiao)上(shang)。

8、任(ren)何(he)反(fan)應試劑(ji)不能接觸(chu)漂(piao)白(bai)溶劑(ji)或(huo)漂(piao)白(bai)溶劑(ji)所散發的強烈氣體。任(ren)何(he)漂(piao)白(bai)成分都會(hui)破(po)壞試劑(ji)盒中反(fan)應試劑(ji)的生物活性(xing)。

9、不能使用過期產品。

10、如果可(ke)能(neng)傳(chuan)播(bo)疾病(bing)，所有的樣品都應管理好(hao)，按照規定的程序處(chu)理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環(huan)境中取出應在室溫平衡后方可使(shi)用。

20×洗滌緩(huan)沖(chong)液(ye)的稀釋(shi)：蒸(zheng)餾(liu)水(shui)按1：20稀釋，即(ji)1份20×洗滌緩沖(chong)液(ye)加19份蒸餾(liu)水(shui)。

操(cao)作步驟

1.從(cong)室溫平(ping)衡20min后的(de)鋁箔袋(dai)中(zhong)取(qu)出(chu)所(suo)需板(ban)條(tiao)，剩余板(ban)條(tiao)用自(zi)封袋(dai)密封放回(hui)4℃。

2. 設置標準(zhun)品孔(kong)和(he)樣(yang)本孔(kong)，標準(zhun)品孔(kong)各加不(bu)同(tong)濃度(du)的標準(zhun)品50μL；

3.樣本孔(kong)中加入待(dai)測樣(yang)本(ben)50μL；空白孔不加。

4. 除空白孔(kong)外，標準品孔(kong)和(he)樣本孔(kong)中(zhong)每孔(kong)加(jia)入辣根過(guo)氧化物酶（HRP）標記的檢測抗(kang)體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水(shui)浴(yu)鍋或恒溫箱溫育(yu)60min。

5. 棄去液體，吸水(shui)紙上(shang)拍干(gan)，每孔加(jia)滿洗滌液（350μL），靜置(zhi)1min，甩去洗滌液，吸水紙(zhi)上拍干，如(ru)此重(zhong)復洗板5次(ci)（也可用洗板機洗板）。

6.每孔(kong)加入底物A、B各50μL，37℃避(bi)光(guang)孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內，在(zai)450nm波長(chang)處測定各孔的(de)OD值。

實驗結果計(ji)算

以(yi)所測標(biao)準品(pin)的OD值為橫坐標，標準品的濃度(du)值為縱(zong)坐標，在坐標紙(zhi)上(shang)或用相關軟件繪(hui)制標(biao)準曲線，并得(de)到直(zhi)線(xian)回歸方(fang)程，將樣品(pin)的OD值代入方程，計算出(chu)樣品的濃度。

試劑盒(he)性(xing)能(neng)

1、檢測范圍：詳見(jian)產品說(shuo)明書。

2、靈敏度：最di檢(jian)測濃度小(xiao)于(yu)0.1 U/L。

3、特(te)異性：不與(yu)其它可溶性結(jie)構類似物交叉(cha)反應。

4、重(zhong)復性：板內變異系數(shu)小(xiao)于10% ，板間變異系數小于15% 。