大鼠PKA-Cα(PKA-Cα）ELISA試劑(ji)盒操作說明

大鼠PKA-Cα(PKA-Cα）ELISA試劑盒實驗原理

大鼠(shu)PKA-Cα(PKA-Cα）ELISA試劑盒(he)采用雙抗(kang)體一步夾心法酶聯免疫吸附試(shi)驗(yan)（ELISA）。往預先包被大鼠PKA-Cα(PKA-Cα）捕獲抗體(ti)的包被微孔(kong)中，依(yi)次加(jia)入標(biao)本、標(biao)準(zhun)品、HRP標記的檢測(ce)抗體(ti)，經(jing)過溫育并徹di洗滌。用底(di)物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下(xia)轉化成藍色，并在酸的作(zuo)用下(xia)轉化成最(zui)終的黃色。顏色的深淺(qian)和樣品(pin)中的大(da)鼠PKA-Cα(PKA-Cα）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算(suan)樣品濃度。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于(yu)血(xue)清(qing)分(fen)離管(guan)的全(quan)血(xue)標本在(zai)室溫放置2小時或4℃過(guo)夜(ye)，然(ran)后(hou)1000×g離心20 分鐘(zhong)，取(qu)上清即可，或將(jiang)上清置于-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免反復凍(dong)融。
2.  血漿：用(yong)EDTA或(huo)(huo)肝素作為抗凝(ning)劑采集標本，并將(jiang)標本在(zai)采集后的30分鐘內于(yu)2-8℃ 1000×g離(li)心15分鐘，取(qu)上(shang)清即可檢測，或(huo)(huo)將(jiang)上(shang)清置(zhi)于(yu)-20℃或(huo)(huo)-80℃保存，但應(ying)避免反(fan)復凍(dong)融。
3. 組織勻漿：用(yong)預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)織(zhi)(zhi)，去(qu)除殘留血液（勻(yun)(yun)漿(jiang)中裂(lie)(lie)解的(de)紅細(xi)胞(bao)會影響測量(liang)結果），稱重(zhong)后(hou)將(jiang)(jiang)組(zu)織(zhi)(zhi)剪(jian)碎。將(jiang)(jiang)剪(jian)碎的(de)組(zu)織(zhi)(zhi)與對應體(ti)(ti)積(ji)的(de)PBS（一(yi)般按1:9的(de)重(zhong)量(liang)體(ti)(ti)積(ji)比(bi)，比(bi)如1g的(de)組(zu)織(zhi)(zhi)樣(yang)品對應9mL的(de)PBS，具體(ti)(ti)體(ti)(ti)積(ji)可(ke)根據實驗需(xu)要(yao)適當調整，并做(zuo)好記(ji)錄。推(tui)薦在PBS中加入蛋白酶(mei)抑制劑）加入玻璃勻(yun)(yun)漿(jiang)器中，于冰(bing)上充分(fen)研磨。為了進一(yi)步(bu)裂(lie)(lie)解組(zu)織(zhi)(zhi)細(xi)胞(bao)，可(ke)以對勻(yun)(yun)漿(jiang)液進行超(chao)聲破碎，或反復凍融。最后(hou)將(jiang)(jiang)勻(yun)(yun)漿(jiang)液于5000×g離心5~10分(fen)鐘，取上清檢測。

4. 細胞(bao)培養物上清或其它生(sheng)物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反(fan)復凍融。

注：標本(ben)溶血(xue)會影響最后(hou)檢測(ce)結(jie)果，因此(ci)溶血(xue)標本(ben)不宜進行(xing)此(ci)項檢測(ce)。

需要而(er)未提(ti)供的試劑(ji)盒器材

1.酶標儀（450nm）

2.高(gao)精度加樣(yang)器及(ji)槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒(heng)溫(wen)箱

4.蒸餾水(shui)或去(qu)離子水(shui)

備注：

1、標準品濃度依次為：詳見(jian)說明書；

2、經過大(da)量正(zheng)常標本(ben)檢驗，標本(ben)的(de)正(zheng)常濃(nong)度值均在試(shi)劑盒提供的(de)檢測(ce)范圍(wei)內，實驗過程(cheng)中直接取(qu)50μL樣(yang)本上(shang)樣(yang)即可。當有部分樣(yang)本值超過最大標準品濃度時，可用樣(yang)本稀釋液將標本進行(xing)適當稀釋后再進行(xing)實驗(yan)。

注意(yi)事項

1、嚴格(ge)按照規(gui)定的時(shi)間和溫(wen)度進行溫(wen)育以(yi)保證準確結果。所有試劑都必(bi)須在使用前達到室溫(wen)20-25℃。使用后立即(ji)冷藏保存試劑(ji)。

2、洗板(ban)不正確可以(yi)導致不準確的結果。在加入底(di)物前確保盡量吸干孔內(nei)液體(ti)(ti)。溫育過(guo)程(cheng)中不要(yao)讓微孔干燥掉。

3、消除板底殘留的(de)液體和(he)手指印，否則影響(xiang)OD值。

4、底(di)(di)物顯色(se)液應(ying)呈(cheng)無(wu)色(se)或(huo)很淺的顏色(se)，已經(jing)變(bian)藍的底(di)(di)物液不能使用。

5、避免試(shi)劑(ji)和標(biao)本(ben)的交叉(cha)污(wu)染(ran)以免造成錯誤結果(guo)。

6、在儲存和溫(wen)育時避免強(qiang)光直接照射。

7、平衡至室(shi)溫后(hou)再打開密封袋(dai)以防水滴凝(ning)聚在冷板條(tiao)上。

8、任(ren)何反應(ying)試(shi)劑(ji)不能(neng)接觸漂(piao)白(bai)(bai)溶(rong)劑(ji)或漂(piao)白(bai)(bai)溶(rong)劑(ji)所散發的強烈氣(qi)體。任(ren)何漂(piao)白(bai)(bai)成分都會破壞試(shi)劑(ji)盒中反應(ying)試(shi)劑(ji)的生物活性。

9、不(bu)能使用(yong)過(guo)期產(chan)品。

10、如果可能(neng)傳播疾病(bing)，所有的(de)樣品都應管理(li)好(hao)，按照(zhao)規(gui)定的(de)程序(xu)處理(li)樣品和檢測裝置(zhi)。

試劑準備

試劑盒從冷藏(zang)環(huan)境中取出應(ying)在室溫平衡(heng)后(hou)方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋(shi)：蒸餾水按1：20稀釋(shi)，即1份20×洗(xi)滌緩沖液(ye)加19份蒸(zheng)餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋(dai)中取出所需板條，剩(sheng)余板條用自封袋(dai)密(mi)封放回4℃。

2. 設置標準(zhun)品(pin)孔和(he)樣本孔，標準(zhun)品(pin)孔各加不同濃度(du)的標準(zhun)品(pin)50μL；

3.樣本(ben)孔中加入待測樣(yang)本50μL；空白(bai)孔(kong)不加。

4. 除空白孔外，標準品孔和(he)樣本孔中每(mei)孔加入辣根過氧化(hua)物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封(feng)板膜封(feng)住反應孔，37℃水(shui)浴鍋(guo)或(huo)恒溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5. 棄去液(ye)(ye)體(ti)，吸(xi)水紙上拍(pai)干，每孔加滿(man)洗(xi)滌液(ye)(ye)（350μL），靜置(zhi)1min，甩去洗(xi)滌液，吸水紙上拍干，如(ru)此(ci)重復洗(xi)板(ban)5次(ci)（也可用洗板機洗板）。

6.每孔(kong)加入底物A、B各(ge)50μL，37℃避光孵育(yu)15min。

7.每孔加入終止液(ye)50μL，15min內，在450nm波長(chang)處測定各孔的OD值。

實驗結果計(ji)算(suan)

以所測標(biao)準品的(de)OD值為橫坐(zuo)標，標準品的(de)濃(nong)度值(zhi)為縱坐(zuo)標(biao)，在坐(zuo)標(biao)紙上(shang)或(huo)用(yong)相關軟件(jian)繪制標準曲線，并得(de)到直線回歸方程，將(jiang)樣品的OD值(zhi)代入方程，計(ji)算出樣品的濃度。

試劑盒性(xing)能(neng)

1、檢測范圍：詳見產品(pin)說明書。

2、靈(ling)敏度：最(zui)di檢(jian)測濃度(du)小于(yu)0.1 U/L。

3、特異性(xing)：不與其它(ta)可溶性(xing)結構類似物交叉反(fan)應。

4、重(zhong)復性：板(ban)內變異系數小于10% ，板間變異(yi)系數(shu)小(xiao)于15% 。