大鼠(shu)PKA-Cβ(PKA-Cβ）ELISA試劑盒(he)產(chan)品說明

大鼠PKA-Cβ(PKA-Cβ）ELISA試(shi)劑盒實驗原理

大鼠(shu)PKA-Cβ(PKA-Cβ）ELISA試(shi)劑(ji)盒采用雙(shuang)抗體(ti)一步夾心法(fa)酶(mei)聯(lian)免疫(yi)吸附(fu)試驗(yan)（ELISA）。往預先(xian)包(bao)被大鼠PKA-Cβ(PKA-Cβ）捕(bu)獲抗體(ti)的(de)包被微孔(kong)中，依次加入(ru)標(biao)(biao)本、標(biao)(biao)準品、HRP標記的(de)檢測抗(kang)體，經過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯(xian)色(se)，TMB在過(guo)氧(yang)化(hua)物酶(mei)的催(cui)化(hua)下轉(zhuan)(zhuan)化(hua)成藍色(se)，并在酸的作用下轉(zhuan)(zhuan)化(hua)成最(zui)終的黃色(se)。顏色(se)的深(shen)淺和樣品(pin)中(zhong)的大鼠PKA-Cβ(PKA-Cβ）呈(cheng)正相關。用(yong)酶標儀在450nm 波長下測定(ding)吸光度（OD 值），計算樣品(pin)濃(nong)度。

樣(yang)本(ben)處理(li)及要(yao)求

1.  血清：將收集于血清分離管的(de)全血標本(ben)在室溫(wen)放置2小(xiao)時或(huo)4℃過夜，然后1000×g離(li)心20 分鐘，取上清即可(ke)，或(huo)將上清置于-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但應避免反(fan)復凍(dong)融。
2.  血漿(jiang)：用EDTA或肝(gan)素作為抗凝劑(ji)采(cai)(cai)集(ji)標本(ben)，并將標本(ben)在采(cai)(cai)集(ji)后(hou)的(de)30分(fen)(fen)鐘(zhong)內(nei)于2-8℃ 1000×g離心15分(fen)(fen)鐘(zhong)，取上清即可檢測(ce)，或將上清置于-20℃或-80℃保存(cun)，但應避免(mian)反復凍融。
3. 組織(zhi)勻漿：用預(yu)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)織(zhi)，去除殘留血液(ye)(ye)（勻漿(jiang)中裂(lie)(lie)解的(de)(de)紅細胞(bao)(bao)會影響測(ce)量結果），稱重后(hou)(hou)將(jiang)組(zu)織(zhi)剪(jian)碎(sui)(sui)。將(jiang)剪(jian)碎(sui)(sui)的(de)(de)組(zu)織(zhi)與對(dui)應體(ti)(ti)(ti)(ti)積(ji)的(de)(de)PBS（一(yi)般按1:9的(de)(de)重量體(ti)(ti)(ti)(ti)積(ji)比，比如1g的(de)(de)組(zu)織(zhi)樣(yang)品對(dui)應9mL的(de)(de)PBS，具體(ti)(ti)(ti)(ti)體(ti)(ti)(ti)(ti)積(ji)可根據實驗需要適當(dang)調整，并做(zuo)好記錄。推薦在PBS中加入(ru)蛋(dan)白酶抑(yi)制劑）加入(ru)玻璃勻漿(jiang)器中，于(yu)(yu)冰上(shang)充分研(yan)磨。為了進一(yi)步裂(lie)(lie)解組(zu)織(zhi)細胞(bao)(bao)，可以對(dui)勻漿(jiang)液(ye)(ye)進行超聲破碎(sui)(sui)，或反復凍融。最后(hou)(hou)將(jiang)勻漿(jiang)液(ye)(ye)于(yu)(yu)5000×g離心5~10分鐘(zhong)，取上(shang)清檢測(ce)。

4. 細(xi)胞(bao)培養物(wu)(wu)上清或(huo)其它生(sheng)物(wu)(wu)標本：請1000×g離心20分鐘，取上(shang)(shang)清(qing)(qing)即可檢(jian)測，或將(jiang)上(shang)(shang)清(qing)(qing)置于-20℃或-80℃保(bao)存(cun)，但應避免反復(fu)凍融。

注(zhu)：標(biao)本(ben)(ben)溶血會影響(xiang)最后檢(jian)測結果(guo)，因此溶血標(biao)本(ben)(ben)不宜進行(xing)此項檢(jian)測。

需要而未提(ti)供的試(shi)劑盒器材

1.酶標儀(yi)（450nm）

2.高精度加(jia)樣(yang)器及槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

備注：

1、標準品濃度依次為：詳見說明書；

2、經過大量正常標(biao)本檢驗，標(biao)本的(de)正常濃(nong)度值均在試(shi)劑盒提供(gong)的(de)檢測范圍內(nei)，實驗過程中直接取50μL樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)上(shang)樣(yang)(yang)(yang)即可。當有部分樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)值超過最大標(biao)準(zhun)品濃(nong)度(du)時，可用樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)稀釋液將標(biao)本(ben)(ben)進行適當稀釋后再進行實驗。

注(zhu)意事項

1、嚴格按(an)照規定(ding)的時間和溫(wen)度(du)進(jin)行溫(wen)育以保證準(zhun)確結果。所有試劑(ji)都必須(xu)在使用前(qian)達到室溫(wen)20-25℃。使用后立即冷藏(zang)保存試(shi)劑。

2、洗板不正確(que)可以導致不準確(que)的結果。在加入(ru)底物前確(que)保盡量吸(xi)干孔(kong)(kong)內液體(ti)。溫育過(guo)程中不要讓微孔(kong)(kong)干燥掉。

3、消除板(ban)底殘留的液體和手指(zhi)印，否則(ze)影響(xiang)OD值。

4、底物顯色(se)(se)液應(ying)呈無色(se)(se)或很淺的顏色(se)(se)，已(yi)經變藍的底物液不能(neng)使用(yong)。

5、避免試劑(ji)和標本的交(jiao)叉(cha)污染以免造成錯誤結果(guo)。

6、在儲存和溫育(yu)時避免(mian)強光直(zhi)接照射。

7、平衡(heng)至室溫后(hou)再打開密(mi)封袋以防水(shui)滴凝聚(ju)在(zai)冷(leng)板條上。

8、任(ren)何反(fan)應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fa)的(de)(de)強烈(lie)氣體。任(ren)何漂白成分都(dou)會破壞(huai)試劑盒中反(fan)應試劑的(de)(de)生物活(huo)性。

9、不能使用過期(qi)產品。

10、如果可能(neng)傳播疾病，所有(you)的樣品(pin)都(dou)應管理好，按照規(gui)定的程序處理樣品(pin)和檢(jian)測裝置。

試(shi)劑準(zhun)備

試劑盒從冷藏(zang)環境中取出應在室溫(wen)平衡后方可使用。

20×洗滌緩(huan)沖液的稀(xi)釋：蒸(zheng)餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖(chong)液加19份(fen)蒸餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡(heng)20min后(hou)的鋁箔袋(dai)中取(qu)出所需(xu)板(ban)條，剩余板(ban)條用(yong)自封袋(dai)密封放回4℃。

2. 設(she)置(zhi)標準品孔(kong)和樣本孔(kong)，標準品孔(kong)各加不(bu)同濃度(du)的標準品50μL；

3.樣(yang)本(ben)孔中加入待(dai)測(ce)樣本50μL；空(kong)白(bai)孔不加。

4. 除空白孔(kong)外，標準品孔(kong)和樣本孔(kong)中每孔(kong)加入(ru)辣(la)根(gen)過氧(yang)化物酶（HRP）標(biao)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住(zhu)反應孔，37℃水浴鍋或恒溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5. 棄(qi)去液體，吸水紙上拍干(gan)，每(mei)孔加滿洗滌液（350μL），靜(jing)置1min，甩去洗滌液，吸(xi)水紙上拍干，如(ru)此重(zhong)復洗板5次（也(ye)可(ke)用(yong)洗板機洗板）。

6.每孔加(jia)入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終(zhong)止液50μL，15min內，在450nm波長(chang)處(chu)測定各孔的OD值。

實驗結果計(ji)算

以所測標準(zhun)品的(de)OD值為橫坐標，標準品的濃(nong)度值為縱坐標(biao)，在坐標(biao)紙(zhi)上或用相關軟件繪(hui)制標準曲線(xian)，并(bing)得到直(zhi)線(xian)回歸方程，將樣品的OD值代(dai)入方程，計算出樣品的濃(nong)度(du)。

試劑盒(he)性能

1、檢測范圍：詳見產品說明書。

2、靈敏(min)度：最di檢測濃(nong)度小于0.1 U/L。

3、特異性：不與(yu)其(qi)它可(ke)溶性結(jie)構類似物(wu)交叉反應。

4、重復性(xing)：板內(nei)變異(yi)系數小(xiao)于10% ，板間(jian)變異(yi)系(xi)數小于15% 。