大鼠(shu)外泌體(Exosome）ELISA試劑盒操作說明

大鼠外泌體(Exosome）ELISA試劑(ji)盒實驗原理(li)

大鼠外泌體(Exosome）ELISA試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附(fu)試驗（ELISA）。往預先包被(bei)大(da)鼠外泌體(Exosome）捕獲抗體的包被(bei)微孔中(zhong)，依次加入標本、標準品、HRP標(biao)記(ji)的檢測(ce)抗體(ti)，經過溫育(yu)并徹di洗滌。用底物TMB顯(xian)色(se)(se)，TMB在(zai)過氧化(hua)(hua)物酶的(de)催(cui)化(hua)(hua)下(xia)轉化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)藍色(se)(se)，并在(zai)酸(suan)的(de)作(zuo)用下(xia)轉化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)最終(zhong)的(de)黃色(se)(se)。顏(yan)色(se)(se)的(de)深淺和樣品中的(de)大鼠外泌(mi)體(ti)(Exosome）呈正(zheng)相關。用酶標儀在450nm 波長下測(ce)定吸光度(du)（OD 值），計算樣品濃度(du)。

樣本處理(li)及要求(qiu)

1.  血(xue)清：將收集于(yu)血(xue)清分(fen)離管的全血(xue)標本在室(shi)溫放置2小時或(huo)4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取(qu)上(shang)清即可，或(huo)將上(shang)清置(zhi)于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.  血漿(jiang)：用EDTA或肝素作為抗凝劑(ji)采(cai)集標本(ben)，并將標本(ben)在采(cai)集后的30分鐘(zhong)內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘(zhong)，取上清(qing)即可檢(jian)測，或將上清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免反(fan)復凍融。
3. 組(zu)織勻漿：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織(zhi)，去除殘留(liu)血液(ye)(ye)（勻漿中(zhong)裂解(jie)(jie)的紅細胞會(hui)影響測量(liang)結果），稱重后將組織(zhi)剪碎。將剪碎的組織(zhi)與對應體(ti)積(ji)的PBS（一(yi)般(ban)按1:9的重量(liang)體(ti)積(ji)比(bi)(bi)，比(bi)(bi)如1g的組織(zhi)樣品對應9mL的PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可根據實驗需要適當調(diao)整，并做好記錄。推薦在PBS中(zhong)加入(ru)蛋白酶抑(yi)制劑(ji)）加入(ru)玻璃勻漿器中(zhong)，于冰上(shang)充分研磨。為(wei)了進(jin)(jin)一(yi)步裂解(jie)(jie)組織(zhi)細胞，可以對勻漿液(ye)(ye)進(jin)(jin)行(xing)超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液(ye)(ye)于5000×g離心5~10分鐘，取上(shang)清檢測。

4. 細胞培養物上清(qing)或其它生物標本(ben)：請1000×g離(li)心(xin)20分鐘，取上(shang)清即可檢測，或將上(shang)清置于(yu)-20℃或-80℃保存，但應(ying)避(bi)免反復凍(dong)融。

注：標本溶血會影響最后檢測結果，因此(ci)溶血標本不宜進行此(ci)項(xiang)檢測。

需要(yao)而未提供的(de)試(shi)劑盒器材(cai)

1.酶(mei)標儀（450nm）

2.高精(jing)度加樣器及(ji)槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫(wen)箱

4.蒸餾水或(huo)去離子水

備注：

1、標準品濃度(du)依(yi)次為：詳見說明書；

2、經過大量正(zheng)常標本檢驗(yan)，標本的(de)正(zheng)常濃度值均在(zai)試劑(ji)盒提(ti)供的(de)檢測范圍內，實驗(yan)過程中(zhong)直接取50μL樣本(ben)上樣即可。當有部分(fen)樣本(ben)值超過最(zui)大(da)標(biao)準品濃度(du)時(shi)，可用樣本(ben)稀釋液將標(biao)本(ben)進(jin)行適當稀釋后再進(jin)行實驗。

注(zhu)意事項

1、嚴格按照規定的(de)時間和溫度進行溫育以保(bao)證(zheng)準確(que)結果。所有試劑都必須在使(shi)用前(qian)達到室(shi)溫20-25℃。使用后(hou)立即冷藏保(bao)存試劑。

2、洗板不(bu)正確(que)可(ke)以導致不(bu)準確(que)的結果。在加入底物(wu)前確(que)保盡(jin)量吸干孔(kong)內(nei)液體。溫育過程中(zhong)不(bu)要(yao)讓微(wei)孔(kong)干燥掉。

3、消除板底殘留的液(ye)體(ti)和手指印，否則影響OD值。

4、底物(wu)顯色(se)液應呈無色(se)或很(hen)淺的(de)顏色(se)，已(yi)經變藍的(de)底物(wu)液不能使用(yong)。

5、避(bi)免試劑和標(biao)本的交叉污染以免造(zao)成錯誤(wu)結(jie)果(guo)。

6、在儲存和溫育時(shi)避免強光直(zhi)接照(zhao)射。

7、平衡至室(shi)溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條(tiao)上。

8、任何(he)反應(ying)試(shi)劑(ji)不能接觸(chu)漂(piao)白溶劑(ji)或(huo)漂(piao)白溶劑(ji)所(suo)散發的(de)強烈氣體(ti)。任何(he)漂(piao)白成分(fen)都會破壞試(shi)劑(ji)盒(he)中反應(ying)試(shi)劑(ji)的(de)生物(wu)活性。

9、不能使用過期產品。

10、如果可能傳(chuan)播疾病，所有的(de)樣品都(dou)應管理好，按照(zhao)規定的(de)程(cheng)序處(chu)理樣品和(he)檢(jian)測裝置。

試劑(ji)準備

試劑盒從冷藏環(huan)境(jing)中取出(chu)應在室溫平(ping)衡(heng)后方可使用。

20×洗滌緩沖(chong)液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作(zuo)步驟

1.從室溫平衡20min后的(de)鋁(lv)箔袋(dai)中取(qu)出所需板條，剩余板條用自封(feng)袋(dai)密(mi)封(feng)放回4℃。

2. 設置標(biao)準品(pin)孔和樣本孔，標(biao)準品(pin)孔各加不同濃度的(de)標(biao)準品(pin)50μL；

3.樣(yang)本孔中(zhong)加入待(dai)測樣本(ben)50μL；空(kong)白孔不加。

4. 除空白孔(kong)外，標準品孔(kong)和(he)樣本(ben)孔(kong)中(zhong)每(mei)孔(kong)加入(ru)辣(la)根過氧化物酶（HRP）標記(ji)的檢測抗體(ti)100μL，用(yong)封板膜封住(zhu)反應孔(kong)，37℃水浴鍋或恒溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干(gan)，每孔加滿洗(xi)滌(di)液（350μL），靜(jing)置1min，甩去洗滌(di)液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可(ke)用洗(xi)板機(ji)洗(xi)板）。

6.每孔(kong)加入(ru)底物A、B各50μL，37℃避光孵(fu)育15min。

7.每孔(kong)加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定(ding)各孔的OD值。

實驗結果計算(suan)

以(yi)所測(ce)標準品的OD值為橫(heng)坐標，標準品的濃(nong)度值為縱(zong)坐(zuo)標(biao)，在(zai)坐(zuo)標(biao)紙上或用相關(guan)軟件繪制標(biao)準(zhun)曲線，并得到直線(xian)回歸方程，將樣(yang)品的OD值代(dai)入方程(cheng)，計算出樣品的濃(nong)度(du)。

試劑盒性能

1、檢測范圍：詳見產品(pin)說明書。

2、靈(ling)敏(min)度(du)：最di檢測濃(nong)度小于0.1 U/L。

3、特異性：不與其(qi)它可溶性結(jie)構(gou)類似物交叉反應。

4、重復性：板內變異系數小(xiao)于10% ，板間(jian)變異(yi)系數小于15% 。