大鼠血肌酐(Cr）ELISA試劑盒課(ke)題研究

大鼠血肌(ji)酐(gan)(Cr）ELISA試劑盒實驗(yan)原理

大鼠(shu)血肌酐(Cr）ELISA試(shi)劑(ji)盒采用雙抗(kang)體(ti)一步夾心法酶聯免疫吸附(fu)試驗（ELISA）。往預先(xian)包被(bei)大(da)鼠(shu)血肌酐(Cr）捕獲(huo)抗體的包被微孔(kong)中，依次加入標本、標準品(pin)、HRP標記的檢測抗體(ti)，經過溫(wen)育(yu)并徹di洗滌。用底物TMB顯色(se)，TMB在過(guo)氧化(hua)(hua)物酶的(de)催化(hua)(hua)下轉化(hua)(hua)成藍色(se)，并在酸的(de)作用下轉化(hua)(hua)成最終的(de)黃色(se)。顏色(se)的(de)深(shen)淺(qian)和(he)樣品中的(de)大鼠血(xue)肌酐(Cr）呈正(zheng)相(xiang)關。用酶標儀在450nm 波長下測(ce)定吸光(guang)度（OD 值），計算樣品濃度。

樣本處理(li)及要(yao)求(qiu)

1.  血清：將(jiang)收集于血清(qing)分離(li)管的全血標本在室溫放置(zhi)2小時或4℃過(guo)夜(ye)，然后1000×g離心20 分鐘(zhong)，取上清(qing)即可，或將上清(qing)置于(yu)-20℃或-80℃保存(cun)，但(dan)應(ying)避免反(fan)復(fu)凍融。
2.  血漿(jiang)：用EDTA或(huo)(huo)肝素作為抗凝(ning)劑采集(ji)標本(ben)，并將(jiang)標本(ben)在采集(ji)后的30分(fen)鐘內(nei)于2-8℃ 1000×g離心15分(fen)鐘，取上清即可檢測(ce)，或(huo)(huo)將(jiang)上清置于-20℃或(huo)(huo)-80℃保存，但(dan)應避(bi)免反復(fu)凍融。
3. 組織(zhi)勻漿：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組織，去除殘(can)留血液（勻漿(jiang)(jiang)(jiang)中裂解的(de)(de)紅細胞會影響測量(liang)結(jie)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的(de)(de)組織與對應體積的(de)(de)PBS（一般按(an)1:9的(de)(de)重量(liang)體積比(bi)，比(bi)如1g的(de)(de)組織樣品對應9mL的(de)(de)PBS，具體體積可(ke)根據(ju)實驗(yan)需要適當(dang)調整(zheng)，并做(zuo)好記錄。推薦在PBS中加入蛋白(bai)酶抑制劑）加入玻璃勻漿(jiang)(jiang)(jiang)器中，于(yu)冰(bing)上充分(fen)研磨。為了進(jin)一步裂解組織細胞，可(ke)以對勻漿(jiang)(jiang)(jiang)液進(jin)行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿(jiang)(jiang)(jiang)液于(yu)5000×g離心5~10分(fen)鐘，取(qu)上清檢測。

4. 細(xi)胞培養物(wu)上清(qing)或(huo)其它生物(wu)標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即(ji)可檢測，或(huo)將上清置于-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但應避免(mian)反復凍融。

注：標本(ben)溶血(xue)會影響最后檢(jian)測結果，因此溶血(xue)標本(ben)不宜進行此項檢(jian)測。

需(xu)要而未提供(gong)的試劑盒(he)器材

1.酶標儀(yi)（450nm）

2.高精度加樣器(qi)及(ji)槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫(wen)箱

4.蒸餾(liu)水(shui)或(huo)去離(li)子水(shui)

備(bei)注(zhu)：

1、標準品濃度依次(ci)為：詳見(jian)說明(ming)書；

2、經過大量正常標本檢驗(yan)，標本的正常濃度值(zhi)均在試劑盒提(ti)供的檢測范圍(wei)內，實(shi)驗(yan)過程(cheng)中直(zhi)接(jie)取50μL樣(yang)本(ben)上樣(yang)即可。當有部分樣(yang)本(ben)值超過(guo)最(zui)大標準品濃度時，可用(yong)樣(yang)本(ben)稀釋(shi)液將標本(ben)進(jin)行適當稀釋(shi)后(hou)再進(jin)行實驗。

注意事項(xiang)

1、嚴(yan)格按照規定(ding)的(de)時(shi)間(jian)和溫度(du)進行(xing)溫育以保(bao)證準確結(jie)果。所有試劑(ji)都必須(xu)在使(shi)用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷(leng)藏(zang)保存(cun)試劑。

2、洗(xi)板(ban)不(bu)正確可以導致不(bu)準確的結果。在加(jia)入底物前(qian)確保盡量吸干孔(kong)內液體。溫(wen)育過程中不(bu)要讓微孔(kong)干燥掉。

3、消除板(ban)底殘(can)留(liu)的液體(ti)和手指印，否則影響OD值(zhi)。

4、底物顯(xian)色液應(ying)呈無色或很淺的(de)顏色，已經(jing)變藍(lan)的(de)底物液不能使用。

5、避免(mian)試(shi)劑(ji)和標本(ben)的交叉(cha)污染(ran)以免(mian)造(zao)成錯誤結果。

6、在儲存和溫育時避免強光直(zhi)接照射。

7、平衡至(zhi)室溫(wen)后再打開密封袋以防(fang)水滴凝(ning)聚(ju)在冷板(ban)條上。

8、任何反應(ying)試(shi)劑(ji)不能接觸漂(piao)白(bai)溶劑(ji)或漂(piao)白(bai)溶劑(ji)所散(san)發的強烈氣(qi)體。任何漂(piao)白(bai)成分都會破(po)壞試(shi)劑(ji)盒(he)中反應(ying)試(shi)劑(ji)的生物活性。

9、不能(neng)使用過期(qi)產品。

10、如(ru)果可能傳(chuan)播疾病，所有的(de)樣(yang)品(pin)都(dou)應管理好，按(an)照規(gui)定的(de)程序處(chu)理樣(yang)品(pin)和檢測裝置(zhi)。

試劑(ji)準備

試(shi)劑盒(he)從(cong)冷藏環(huan)境中取(qu)出(chu)應(ying)在(zai)室(shi)溫平衡后方(fang)可使用(yong)。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀(xi)釋(shi)，即1份20×洗滌緩沖(chong)液(ye)加19份蒸餾水。

操(cao)作步驟

1.從室(shi)溫(wen)平(ping)衡20min后的鋁(lv)箔袋中取出所需板(ban)條，剩余板(ban)條用(yong)自封袋密封放回4℃。

2. 設(she)置標準(zhun)品(pin)孔和(he)樣(yang)本孔，標準(zhun)品(pin)孔各加(jia)不同濃度的標準(zhun)品(pin)50μL；

3.樣(yang)本孔中(zhong)加入待測樣(yang)本50μL；空(kong)白孔不加。

4. 除空白孔(kong)外，標準(zhun)品(pin)孔(kong)和樣本(ben)孔(kong)中每孔(kong)加入辣根過氧(yang)化物(wu)酶（HRP）標記的檢(jian)測抗體100μL，用(yong)封(feng)板膜封(feng)住反應孔，37℃水浴鍋(guo)或恒溫箱溫育(yu)60min。

5. 棄去液體(ti)，吸水紙(zhi)上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置(zhi)1min，甩去洗(xi)滌液，吸水(shui)紙上(shang)拍干，如此(ci)重(zhong)復洗(xi)板(ban)5次（也可用洗(xi)板機洗(xi)板）。

6.每孔(kong)加入底(di)物A、B各50μL，37℃避光孵(fu)育15min。

7.每孔(kong)加入(ru)終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的(de)OD值。

實驗結果計算

以所(suo)測標準品(pin)的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱(zong)坐(zuo)標，在(zai)坐(zuo)標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣(yang)品的OD值代入方(fang)程，計算出樣品的濃度。

試(shi)劑盒性能

1、檢測范圍(wei)：詳見產品說明書。

2、靈敏度：最di檢測濃(nong)度小于0.1 U/L。

3、特異性(xing)：不與(yu)其它可溶(rong)性(xing)結(jie)構類似物交叉反應(ying)。

4、重復性：板內變(bian)異系(xi)數小于10% ，板(ban)間(jian)變異系數小(xiao)于(yu)15% 。