大鼠尿(niao)糖(Ug）ELISA試(shi)劑盒操作說明

大鼠尿糖(Ug）ELISA試(shi)劑盒實驗原理(li)

大鼠尿糖(Ug）ELISA試劑盒采用雙(shuang)抗體(ti)一步夾(jia)心法酶聯免疫吸(xi)附試驗(yan)（ELISA）。往預先包被大鼠尿糖(Ug）捕獲抗體的包(bao)被微孔(kong)中，依次加(jia)入(ru)標(biao)本、標(biao)準(zhun)品、HRP標(biao)記的檢測抗(kang)體(ti)，經過(guo)溫育(yu)并徹di洗滌。用底物TMB顯(xian)色(se)，TMB在過氧(yang)化(hua)物酶的(de)催(cui)化(hua)下轉化(hua)成(cheng)藍色(se)，并在酸的(de)作用下轉化(hua)成(cheng)最終的(de)黃色(se)。顏色(se)的(de)深淺(qian)和樣品中的(de)大鼠尿糖(Ug）呈正(zheng)相關。用酶標儀在450nm 波長(chang)下測定(ding)吸光度（OD 值(zhi)），計算樣品濃度。

樣本處(chu)理及要求

1.  血(xue)清：將收(shou)集于血清(qing)分離(li)管(guan)的全血標(biao)本在(zai)室(shi)溫放(fang)置2小時(shi)或(huo)4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清(qing)即可(ke)，或(huo)將上清(qing)置于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但(dan)應避免反復凍融。
2.  血(xue)漿：用EDTA或(huo)肝素作為抗凝劑采(cai)集(ji)標(biao)本，并(bing)將標(biao)本在采(cai)集(ji)后的30分(fen)(fen)鐘內(nei)于2-8℃ 1000×g離心15分(fen)(fen)鐘，取上清(qing)(qing)即可檢測，或(huo)將上清(qing)(qing)置(zhi)于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反(fan)復凍融。
3. 組織勻(yun)漿：用(yong)預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)織(zhi)，去除殘留(liu)血(xue)液（勻漿中裂解的紅(hong)細(xi)胞會影響測量(liang)結果(guo)），稱重后將組(zu)織(zhi)剪碎(sui)(sui)(sui)。將剪碎(sui)(sui)(sui)的組(zu)織(zhi)與對應體積(ji)的PBS（一般(ban)按(an)1:9的重量(liang)體積(ji)比，比如1g的組(zu)織(zhi)樣品對應9mL的PBS，具體體積(ji)可根據實驗需要適當調整，并做(zuo)好記錄。推(tui)薦在(zai)PBS中加入蛋白酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研(yan)磨。為了進一步裂解組(zu)織(zhi)細(xi)胞，可以對勻漿液進行(xing)超(chao)聲破碎(sui)(sui)(sui)，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘(zhong)，取(qu)上清檢測。

4. 細胞培養物上(shang)清或(huo)其它生物標(biao)本：請(qing)1000×g離心20分鐘，取(qu)上清即可檢測，或將上清置于(yu)-20℃或-80℃保(bao)存，但應避(bi)免反復凍融。

注：標(biao)本溶血會影響最后檢(jian)測(ce)結果，因此(ci)溶血標(biao)本不宜進(jin)行此(ci)項檢(jian)測(ce)。

需要而未提供(gong)的試劑盒器材

1.酶標儀(yi)（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒(heng)溫箱

4.蒸餾水或(huo)去離子水

備注(zhu)：

1、標準品(pin)濃度依次為(wei)：詳見說明書；

2、經過大量正(zheng)(zheng)常(chang)標本檢驗(yan)，標本的(de)正(zheng)(zheng)常(chang)濃度值均在試(shi)劑(ji)盒(he)提供(gong)的(de)檢測范(fan)圍內，實驗(yan)過程中直接取50μL樣(yang)(yang)(yang)本(ben)上樣(yang)(yang)(yang)即可。當有部(bu)分樣(yang)(yang)(yang)本(ben)值超過最大標(biao)準(zhun)品濃度(du)時，可用樣(yang)(yang)(yang)本(ben)稀釋(shi)液將標(biao)本(ben)進行(xing)適當稀釋(shi)后再進行(xing)實驗。

注意(yi)事項

1、嚴格按照規定的時間和溫度進(jin)行溫育以保證(zheng)準確結果。所有試(shi)劑都必須(xu)在使用前(qian)達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2、洗板不正(zheng)確可以導(dao)致不準(zhun)確的(de)結果。在加入底物(wu)前確保(bao)盡量吸干孔(kong)內(nei)液(ye)體。溫育過程中不要讓微孔(kong)干燥掉(diao)。

3、消除板底殘(can)留的(de)液(ye)體和手指印，否則影響OD值。

4、底(di)物顯色液應呈無(wu)色或很淺(qian)的顏色，已經變藍(lan)的底(di)物液不能使(shi)用。

5、避免試(shi)劑和標本(ben)的交叉污(wu)染以免造成錯誤結果。

6、在儲存和溫育(yu)時(shi)避免(mian)強光直接照射。

7、平衡至室溫后再打開(kai)密封袋以防水滴(di)凝聚(ju)在(zai)冷(leng)板條(tiao)上。

8、任何反應(ying)試(shi)劑(ji)(ji)不能接觸漂白(bai)溶(rong)劑(ji)(ji)或漂白(bai)溶(rong)劑(ji)(ji)所(suo)散發(fa)的強烈(lie)氣體(ti)。任何漂白(bai)成分(fen)都會(hui)破壞試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)中(zhong)反應(ying)試(shi)劑(ji)(ji)的生物(wu)活性。

9、不能使(shi)用(yong)過期產品(pin)。

10、如果可能傳播疾病，所(suo)有的(de)樣(yang)品都應管理好，按照規(gui)定的(de)程序處理樣(yang)品和(he)檢測(ce)裝置。

試劑準備

試劑盒(he)從冷藏環境(jing)中取出應在室溫平(ping)衡(heng)后方可(ke)使用。

20×洗滌(di)緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗(xi)滌緩沖液(ye)加(jia)19份蒸(zheng)餾水。

操作步驟(zou)

1.從(cong)室溫平衡(heng)20min后的鋁箔袋中取出所需(xu)板條(tiao)，剩余(yu)板條(tiao)用自封(feng)袋密封(feng)放回4℃。

2. 設置標準品(pin)(pin)孔(kong)和樣本孔(kong)，標準品(pin)(pin)孔(kong)各加不同濃度(du)的標準品(pin)(pin)50μL；

3.樣本孔中加入待測樣(yang)本(ben)50μL；空白(bai)孔不加。

4. 除空白(bai)孔(kong)外，標準品(pin)孔(kong)和樣本孔(kong)中每孔(kong)加入辣(la)根過氧化(hua)物酶（HRP）標記的檢(jian)測抗體(ti)(ti)100μL，用封(feng)板膜封(feng)住反應孔(kong)，37℃水浴鍋或恒(heng)溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5. 棄去液體，吸水紙(zhi)上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置(zhi)1min，甩(shuai)去洗滌液，吸(xi)水(shui)紙上(shang)拍(pai)干，如此(ci)重(zhong)復洗板5次（也可用洗(xi)板機洗(xi)板）。

6.每孔加(jia)入底(di)物(wu)A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nei)，在450nm波(bo)長處測(ce)定各孔(kong)的OD值(zhi)。

實(shi)驗(yan)結果計算(suan)

以所(suo)測(ce)標(biao)準品的(de)OD值為橫坐標(biao)，標準品的濃度(du)值為縱坐標(biao)，在坐標(biao)紙上或(huo)用相關軟件繪制標準曲線，并得到直(zhi)線回(hui)歸方程，將(jiang)樣品的OD值(zhi)代入(ru)方程，計算出樣品(pin)的(de)濃度。

試劑(ji)盒性(xing)能

1、檢測范圍：詳見產(chan)品說明書(shu)。

2、靈敏度：最(zui)di檢測濃(nong)度小于0.1 U/L。

3、特異(yi)性(xing)：不與其它可溶性(xing)結構(gou)類似物交(jiao)叉(cha)反應。

4、重復性(xing)：板內(nei)變異(yi)系(xi)數小(xiao)于10% ，板(ban)間變異系數(shu)小于(yu)15% 。