人(ren)廣譜細(xi)胞角蛋白(P-CK）ELISA試(shi)劑盒課題研究

人廣譜(pu)細(xi)胞角蛋白(P-CK）ELISA試(shi)劑(ji)盒實驗(yan)原理

人廣譜細(xi)胞角蛋白(P-CK）ELISA試(shi)劑盒(he)采用(yong)雙抗體一(yi)步夾(jia)心法酶聯(lian)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被(bei)人(ren)廣譜細胞角蛋(dan)白(P-CK）捕獲抗(kang)體的包(bao)被微孔中，依次加入標(biao)(biao)本、標(biao)(biao)準(zhun)品、HRP標記的檢測(ce)抗體(ti)，經過(guo)溫育并徹di洗滌。用底(di)物(wu)TMB顯色(se)(se)，TMB在過(guo)氧化(hua)(hua)物酶的(de)催化(hua)(hua)下轉(zhuan)化(hua)(hua)成(cheng)藍色(se)(se)，并在酸的(de)作(zuo)用下轉(zhuan)化(hua)(hua)成(cheng)最終的(de)黃色(se)(se)。顏色(se)(se)的(de)深淺和樣品中的(de)人廣譜細胞角蛋(dan)白(bai)(P-CK）呈正相(xiang)關(guan)。用酶標儀在450nm 波長下測(ce)定(ding)吸光(guang)度(du)（OD 值），計算(suan)樣品濃(nong)度(du)。

樣本處理及要求(qiu)

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然(ran)后1000×g離心20 分鐘，取上(shang)清即可(ke)，或將上(shang)清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復(fu)凍融(rong)。
2.  血漿(jiang)：用EDTA或肝素作為抗凝劑采(cai)集(ji)(ji)標本，并將標本在(zai)采(cai)集(ji)(ji)后的30分(fen)鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分(fen)鐘，取(qu)上清即可檢(jian)測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免反復(fu)凍融(rong)。
3. 組織(zhi)勻漿(jiang)：用預冷(leng)的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織(zhi)(zhi)，去除殘留血液（勻(yun)漿(jiang)(jiang)(jiang)中裂(lie)解(jie)的(de)(de)(de)(de)紅(hong)細胞會影響(xiang)測量結果），稱重(zhong)后將組織(zhi)(zhi)剪碎。將剪碎的(de)(de)(de)(de)組織(zhi)(zhi)與對應體(ti)積的(de)(de)(de)(de)PBS（一般按(an)1:9的(de)(de)(de)(de)重(zhong)量體(ti)積比，比如1g的(de)(de)(de)(de)組織(zhi)(zhi)樣品對應9mL的(de)(de)(de)(de)PBS，具(ju)體(ti)體(ti)積可(ke)根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在(zai)PBS中加入蛋白(bai)酶抑制劑）加入玻璃勻(yun)漿(jiang)(jiang)(jiang)器(qi)中，于冰上(shang)充分(fen)研磨(mo)。為了進一步裂(lie)解(jie)組織(zhi)(zhi)細胞，可(ke)以對勻(yun)漿(jiang)(jiang)(jiang)液進行超(chao)聲破碎，或反復凍融。最后將勻(yun)漿(jiang)(jiang)(jiang)液于5000×g離(li)心5~10分(fen)鐘，取上(shang)清檢測。

4. 細胞培養物上清或(huo)其(qi)它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可(ke)檢(jian)測，或(huo)將(jiang)上清置(zhi)于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍(dong)融。

注：標本(ben)(ben)溶(rong)血會影響最后檢(jian)測結果(guo)，因此溶(rong)血標本(ben)(ben)不宜(yi)進行此項檢(jian)測。

需要而未提供的試劑盒器(qi)材

1.酶標儀(yi)（450nm）

2.高精度加樣器(qi)及槍(qiang)頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水(shui)或去離子(zi)水(shui)

備注：

1、標準品濃度依(yi)次為：詳(xiang)見說明書；

2、經過大量正常標(biao)本檢驗，標(biao)本的正常濃度(du)值均在試劑盒提供(gong)的檢測范圍內，實驗過程中直接(jie)取50μL樣(yang)本(ben)上(shang)樣(yang)即可。當有部(bu)分(fen)樣(yang)本(ben)值(zhi)超過最大標準品濃(nong)度時(shi)，可用樣(yang)本(ben)稀釋液將(jiang)標本(ben)進行適當稀釋后再進行實驗。

注意事項

1、嚴格(ge)按照規定的時間和溫(wen)度進(jin)行溫(wen)育以(yi)保證(zheng)準確結果。所有(you)試劑都(dou)必須在(zai)使用前(qian)達到室溫(wen)20-25℃。使(shi)用(yong)后立即冷藏保存試(shi)劑。

2、洗板不(bu)正確可(ke)以導致不(bu)準確的結果。在(zai)加(jia)入底物前確保盡量(liang)吸干孔內液體。溫育過(guo)程中不(bu)要(yao)讓微(wei)孔干燥(zao)掉(diao)。

3、消除(chu)板底殘留(liu)的液體(ti)和(he)手(shou)指印，否則影(ying)響OD值。

4、底物(wu)顯色(se)(se)液(ye)(ye)應呈無色(se)(se)或(huo)很淺的顏(yan)色(se)(se)，已經(jing)變(bian)藍的底物(wu)液(ye)(ye)不(bu)能使用。

5、避免試劑和標本的交(jiao)叉污染以免造(zao)成錯誤(wu)結果(guo)。

6、在儲存(cun)和溫(wen)育(yu)時避(bi)免強光(guang)直接照射。

7、平衡(heng)至室溫后再打開密封袋以防水滴(di)凝聚(ju)在冷板條上。

8、任(ren)何反(fan)應試(shi)(shi)劑(ji)不能接觸漂(piao)白溶(rong)(rong)劑(ji)或漂(piao)白溶(rong)(rong)劑(ji)所散發的(de)強烈氣(qi)體。任(ren)何漂(piao)白成分都會破壞試(shi)(shi)劑(ji)盒中反(fan)應試(shi)(shi)劑(ji)的(de)生物活性。

9、不能(neng)使用過(guo)期產品。

10、如果可能傳(chuan)播疾病，所(suo)有的(de)樣品都(dou)應管理好，按照(zhao)規定(ding)的(de)程序處(chu)理樣品和檢(jian)測裝置。

試劑(ji)準備(bei)

試劑(ji)盒從冷藏環(huan)境中取出應在室溫(wen)平(ping)衡(heng)后方可使用。

20×洗滌緩沖(chong)液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗(xi)滌緩沖液(ye)加(jia)19份蒸餾水。

操作步驟

1.從室溫平(ping)衡(heng)20min后的鋁箔袋(dai)中取出所需板條，剩余板條用自封(feng)袋(dai)密封(feng)放(fang)回4℃。

2. 設置標準(zhun)品(pin)孔和樣(yang)本孔，標準(zhun)品(pin)孔各加不同(tong)濃度(du)的標準(zhun)品(pin)50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4. 除空白孔(kong)外，標準品孔(kong)和(he)樣本孔(kong)中每孔(kong)加(jia)入辣根過氧化物(wu)酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住(zhu)反應(ying)孔(kong)，37℃水浴(yu)鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄(qi)去液體，吸(xi)水(shui)紙上拍干(gan)，每(mei)孔(kong)加滿洗滌液（350μL），靜(jing)置1min，甩(shuai)去洗滌(di)液，吸水(shui)紙上拍干，如此重(zhong)復(fu)洗板5次（也可用洗(xi)板機洗(xi)板）。

6.每孔加入(ru)底物A、B各50μL，37℃避光(guang)孵育15min。

7.每孔加(jia)入終止(zhi)液50μL，15min內(nei)，在450nm波長(chang)處測定各孔的(de)OD值。

實(shi)驗結果計(ji)算

以(yi)所測標準(zhun)品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為(wei)縱(zong)坐標(biao)，在坐標(biao)紙上或用相關(guan)軟件繪制(zhi)標準曲線(xian)，并(bing)得到直線回歸方(fang)程(cheng)，將(jiang)樣品的OD值代入方程，計算出樣品(pin)的濃度。

試劑(ji)盒性能

1、檢測范圍：詳見產品說明書(shu)。

2、靈敏度：最di檢測濃度小于0.1 U/L。

3、特異(yi)性(xing)：不與其它可(ke)溶性(xing)結構類似物交叉(cha)反應。

4、重復性：板內變(bian)異系數小于10% ，板間變異系(xi)數小(xiao)于15% 。