人果糖胺(an)(FRA）ELISA試劑盒課題研究

人果糖胺(FRA）ELISA試(shi)劑盒(he)實驗原理

人果(guo)糖胺(FRA）ELISA試劑盒(he)采用雙(shuang)抗體(ti)一步夾心(xin)法(fa)酶聯(lian)免疫吸附試驗(yan)（ELISA）。往預先(xian)包被人果(guo)糖(tang)胺(an)(FRA）捕獲(huo)抗體(ti)的包被微孔中，依次加(jia)入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫(wen)育(yu)并徹(che)di洗滌。用(yong)底物(wu)TMB顯色，TMB在(zai)過氧化物酶的(de)催化下轉化成藍色，并在(zai)酸的(de)作用下轉化成最終的(de)黃色。顏(yan)色的(de)深(shen)淺和樣品中的(de)人果糖胺(FRA）呈正相(xiang)關。用酶標儀在(zai)450nm 波長下測定吸(xi)光度（OD 值），計算樣(yang)品(pin)濃(nong)度。

樣本(ben)處理(li)及要(yao)求

1.  血(xue)清(qing)：將收集(ji)于血清分離管的全(quan)血標本在室溫放置(zhi)2小時(shi)或4℃過夜，然后1000×g離(li)心20 分鐘，取上清即(ji)可，或將上清置(zhi)于(yu)-20℃或-80℃保存，但(dan)應(ying)避免(mian)反復凍(dong)融(rong)。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑(ji)采集標本，并將標本在采集后的(de)30分(fen)鐘內于(yu)2-8℃ 1000×g離心(xin)15分(fen)鐘，取(qu)上清(qing)即可檢測，或將上清(qing)置于(yu)-20℃或-80℃保存(cun)，但應避(bi)免反復凍融(rong)。
3. 組織勻漿(jiang)：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)織，去(qu)除殘留血液（勻(yun)漿中裂解(jie)的(de)(de)紅(hong)細胞會影響測量(liang)結果），稱重后將(jiang)(jiang)組(zu)織剪碎。將(jiang)(jiang)剪碎的(de)(de)組(zu)織與對(dui)應體(ti)積的(de)(de)PBS（一(yi)(yi)般(ban)按1:9的(de)(de)重量(liang)體(ti)積比(bi)，比(bi)如1g的(de)(de)組(zu)織樣品對(dui)應9mL的(de)(de)PBS，具體(ti)體(ti)積可(ke)根據實驗需(xu)要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入(ru)蛋(dan)白酶抑制劑(ji)）加入(ru)玻璃(li)勻(yun)漿器(qi)中，于(yu)冰上充分研磨。為了進一(yi)(yi)步裂解(jie)組(zu)織細胞，可(ke)以對(dui)勻(yun)漿液進行(xing)超聲(sheng)破碎，或反復凍(dong)融。最(zui)后將(jiang)(jiang)勻(yun)漿液于(yu)5000×g離心5~10分鐘，取上清(qing)檢測。

4. 細胞培養物上(shang)清或其它生物標(biao)本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或(huo)將上清置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。

注(zhu)：標本溶血會影(ying)響(xiang)最后(hou)檢測結果，因(yin)此溶血標本不宜進行此項(xiang)檢測。

需(xu)要而未提供的試劑盒(he)器材

1.酶標(biao)儀(yi)（450nm）

2.高(gao)精度(du)加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水(shui)或去離子水(shui)

備注(zhu)：

1、標準品濃度依次為(wei)：詳見(jian)說明書；

2、經過(guo)大量正(zheng)常標(biao)本(ben)檢(jian)驗(yan)，標(biao)本(ben)的(de)正(zheng)常濃(nong)度(du)值均在試(shi)劑(ji)盒提(ti)供(gong)的(de)檢(jian)測范(fan)圍內，實(shi)驗(yan)過(guo)程中直接取(qu)50μL樣(yang)本(ben)(ben)上(shang)樣(yang)即可。當有(you)部分(fen)樣(yang)本(ben)(ben)值超(chao)過最大標準品濃(nong)度時，可用樣(yang)本(ben)(ben)稀釋(shi)液將標本(ben)(ben)進(jin)行(xing)適當稀釋(shi)后再(zai)進(jin)行(xing)實(shi)驗。

注意事項

1、嚴(yan)格按照規定(ding)的(de)時(shi)間和(he)溫(wen)度進行溫(wen)育以(yi)保證準確(que)結果。所(suo)有試(shi)劑都必須在使用前(qian)達到室(shi)溫(wen)20-25℃。使用后立即冷藏保(bao)存試劑。

2、洗(xi)板不正確可以導致不準確的(de)結果。在加入底物前確保盡量吸(xi)干孔內液體。溫育過程(cheng)中不要(yao)讓微孔干燥掉。

3、消除(chu)板底(di)殘留的(de)液體(ti)(ti)和手指(zhi)印，否則影響OD值(zhi)。

4、底物(wu)顯色液(ye)(ye)應呈(cheng)無(wu)色或很淺的顏色，已經(jing)變藍的底物(wu)液(ye)(ye)不能使用。

5、避免(mian)試劑和標本(ben)的交叉(cha)污染以(yi)免(mian)造成錯誤(wu)結(jie)果。

6、在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7、平衡(heng)至室溫后再(zai)打開密封(feng)袋以防水滴(di)凝(ning)聚(ju)在冷(leng)板條(tiao)上(shang)。

8、任何(he)反應(ying)試劑不能接觸漂(piao)白溶(rong)劑或漂(piao)白溶(rong)劑所散發的強(qiang)烈氣體(ti)。任何(he)漂(piao)白成分都會破(po)壞試劑盒中反應(ying)試劑的生物活性。

9、不能(neng)使用(yong)過(guo)期產品。

10、如果可(ke)能傳播疾(ji)病，所(suo)有的樣(yang)品(pin)都應管理(li)好(hao)，按照規定的程序處理(li)樣(yang)品(pin)和檢測裝置。

試劑準(zhun)備

試劑盒從冷(leng)藏(zang)環境中取出應在室溫平衡后(hou)方可使用。

20×洗滌緩(huan)沖液(ye)的稀釋：蒸餾水按(an)1：20稀釋(shi)，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操(cao)作步驟(zou)

1.從室溫(wen)平衡20min后的鋁箔袋(dai)中(zhong)取出所(suo)需板(ban)(ban)條，剩余板(ban)(ban)條用自封袋(dai)密封放回4℃。

2. 設(she)置標準(zhun)品孔(kong)和(he)樣本(ben)孔(kong)，標準(zhun)品孔(kong)各(ge)加不(bu)同濃度的標準(zhun)品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空(kong)白孔不(bu)加。

4. 除空白(bai)孔(kong)(kong)外，標準品孔(kong)(kong)和樣本孔(kong)(kong)中每孔(kong)(kong)加入辣根(gen)過氧化(hua)物酶（HRP）標(biao)記的(de)檢測抗體100μL，用(yong)封板膜封住(zhu)反應(ying)孔，37℃水(shui)浴鍋(guo)或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸水(shui)紙上(shang)拍干，每孔(kong)加滿洗滌(di)液（350μL），靜(jing)置1min，甩去洗滌(di)液，吸水(shui)紙上(shang)拍干，如此重(zhong)復洗板5次(ci)（也可用洗板機洗板）。

6.每(mei)孔(kong)加入底物A、B各50μL，37℃避光(guang)孵(fu)育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波(bo)長處測(ce)定各(ge)孔的OD值(zhi)。

實驗結果計算

以所測標(biao)準品的OD值為橫坐標，標準品的濃(nong)度值為縱坐標(biao)，在坐標(biao)紙(zhi)上或(huo)用相關軟件繪(hui)制(zhi)標準曲線，并(bing)得(de)到直線回歸方程，將(jiang)樣品的OD值代(dai)入方程，計算出樣品的濃度。

試劑盒性(xing)能

1、檢測范圍：詳見(jian)產(chan)品(pin)說(shuo)明書。

2、靈敏(min)度：最di檢測(ce)濃度(du)小(xiao)于0.1 U/L。

3、特(te)異(yi)性(xing)：不(bu)與其它可溶性(xing)結(jie)構類(lei)似(si)物交叉反應。

4、重復性：板(ban)內變異系數小于(yu)10% ，板間(jian)變異(yi)系數(shu)小于(yu)15% 。