人過氧化氫酶(CAT）ELISA試劑盒課題研究

人過氧(yang)化氫酶(CAT）ELISA試劑(ji)盒實驗原理

人過氧(yang)化氫(qing)酶(mei)(CAT）ELISA試(shi)劑盒采(cai)用雙抗體(ti)(ti)一步夾(jia)心法(fa)酶(mei)聯免(mian)疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人過氧化(hua)氫(qing)酶(CAT）捕(bu)獲抗體(ti)的包被微孔中，依次加(jia)入標本、標準品、HRP標(biao)記的檢測抗(kang)體(ti)，經過溫(wen)育并(bing)徹(che)di洗滌。用底物TMB顯(xian)色(se)，TMB在(zai)過氧化(hua)物(wu)酶(mei)的(de)催化(hua)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)藍色(se)，并在(zai)酸的(de)作(zuo)用下(xia)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)最(zui)終(zhong)的(de)黃色(se)。顏色(se)的(de)深(shen)淺(qian)和樣品中的(de)人過氧化氫酶(CAT）呈正相關(guan)。用(yong)酶標儀在450nm 波長下測(ce)定吸光度（OD 值），計算樣品濃(nong)度。

樣本處理(li)及要求

1.  血(xue)清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小(xiao)時或(huo)4℃過夜，然后1000×g離心(xin)20 分鐘(zhong)，取(qu)上清即可，或(huo)將上清置于-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但應避免反(fan)復(fu)凍融(rong)。
2.  血漿：用EDTA或(huo)(huo)肝(gan)素作為抗凝劑采集(ji)標本(ben)，并將標本(ben)在采集(ji)后的(de)30分(fen)鐘(zhong)內于(yu)2-8℃ 1000×g離心15分(fen)鐘(zhong)，取上清即可檢測，或(huo)(huo)將上清置于(yu)-20℃或(huo)(huo)-80℃保存，但應避(bi)免(mian)反復凍融。
3. 組織勻漿：用(yong)預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組織(zhi)，去除殘留血液（勻(yun)漿(jiang)中(zhong)裂(lie)解的紅(hong)細胞會影響測量結(jie)果），稱(cheng)重后(hou)將(jiang)組織(zhi)剪碎(sui)。將(jiang)剪碎(sui)的組織(zhi)與對應(ying)體(ti)積(ji)的PBS（一般按1:9的重量體(ti)積(ji)比(bi)，比(bi)如(ru)1g的組織(zhi)樣品對應(ying)9mL的PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可根據(ju)實驗需要適當調(diao)整，并做好記錄(lu)。推薦在PBS中(zhong)加入蛋(dan)白酶抑制劑）加入玻(bo)璃勻(yun)漿(jiang)器中(zhong)，于冰上充(chong)分研磨。為了(le)進一步裂(lie)解組織(zhi)細胞，可以對勻(yun)漿(jiang)液進行超(chao)聲(sheng)破碎(sui)，或(huo)反復凍融。最后(hou)將(jiang)勻(yun)漿(jiang)液于5000×g離心(xin)5~10分鐘，取上清檢測。

4. 細胞(bao)培(pei)養物上清或其(qi)它(ta)生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即(ji)可檢測(ce)，或將上清置于-20℃或-80℃保存(cun)，但應避免反復凍融。

注：標(biao)本溶(rong)血(xue)會(hui)影響(xiang)最后檢測結果，因此(ci)溶(rong)血(xue)標(biao)本不宜進行此(ci)項檢測。

需(xu)要而未提供的試劑盒(he)器材

1.酶標儀（450nm）

2.高精(jing)度加樣器(qi)及(ji)槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱(xiang)

4.蒸(zheng)餾水或去離子水

備注：

1、標準品濃度依次為：詳(xiang)見說明書；

2、經過大(da)量(liang)正常(chang)標本(ben)檢(jian)驗，標本(ben)的正常(chang)濃度(du)值(zhi)均(jun)在試劑盒提供(gong)的檢(jian)測范圍內，實驗過程(cheng)中直接取50μL樣(yang)(yang)本上樣(yang)(yang)即可。當有(you)部分樣(yang)(yang)本值超過(guo)最大標(biao)準品濃度時，可用樣(yang)(yang)本稀釋液將標(biao)本進行(xing)(xing)適當稀釋后再進行(xing)(xing)實驗。

注意事(shi)項

1、嚴格按(an)照規(gui)定的時(shi)間和溫度進行溫育(yu)以保證(zheng)準確結果(guo)。所有試劑都(dou)必(bi)須在使用前達(da)到室溫20-25℃。使用后立即(ji)冷藏保(bao)存試劑(ji)。

2、洗板(ban)不(bu)正(zheng)確可(ke)以(yi)導致不(bu)準確的結果(guo)。在加(jia)入底(di)物(wu)前確保盡量吸干(gan)孔內液體。溫育過程中不(bu)要讓(rang)微孔干(gan)燥掉。

3、消除(chu)板(ban)底(di)殘(can)留(liu)的液體(ti)和(he)手指印，否則影響(xiang)OD值。

4、底物顯(xian)色液(ye)應呈(cheng)無色或(huo)很淺的(de)顏色，已經變(bian)藍的(de)底物液(ye)不能使(shi)用。

5、避免(mian)試劑和標(biao)本的(de)交叉污染(ran)以免(mian)造成錯(cuo)誤結(jie)果。

6、在(zai)儲(chu)存和溫育時避免(mian)強(qiang)光直接照射。

7、平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝(ning)聚在冷板條上。

8、任(ren)何(he)反應試劑(ji)(ji)不能(neng)接觸漂白溶(rong)劑(ji)(ji)或(huo)漂白溶(rong)劑(ji)(ji)所散發的強烈氣(qi)體(ti)。任(ren)何(he)漂白成分都會破壞(huai)試劑(ji)(ji)盒中反應試劑(ji)(ji)的生物活性。

9、不(bu)能使(shi)用過期產品。

10、如果可能(neng)傳播疾(ji)病，所有(you)的樣(yang)品(pin)都(dou)應管(guan)理好，按照(zhao)規定的程序處理樣(yang)品(pin)和檢測裝置。

試劑(ji)準(zhun)備

試劑盒從(cong)冷(leng)藏環境中(zhong)取出應在室溫平衡后方可使用。

20×洗(xi)滌緩沖液(ye)的稀釋：蒸餾(liu)水按(an)1：20稀釋(shi)，即1份20×洗(xi)滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.從(cong)室溫平衡20min后(hou)的鋁箔袋中取出所需板條，剩余(yu)板條用自封袋密封放回(hui)4℃。

2. 設置標準(zhun)品孔和樣本孔，標準(zhun)品孔各加不(bu)同濃度的標準(zhun)品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔(kong)不加(jia)。

4. 除空(kong)白孔(kong)外，標準品(pin)孔(kong)和樣本(ben)孔(kong)中每孔(kong)加入辣(la)根過(guo)氧化(hua)物酶（HRP）標記(ji)的檢(jian)測(ce)抗(kang)體100μL，用封(feng)板膜封(feng)住反應孔，37℃水(shui)浴鍋或(huo)恒(heng)溫箱(xiang)溫育(yu)60min。

5. 棄(qi)去液體，吸水紙上(shang)拍干(gan)，每孔加滿(man)洗(xi)滌(di)液（350μL），靜(jing)置1min，甩去洗(xi)滌液(ye)，吸水紙上拍干，如此(ci)重復洗(xi)板5次(ci)（也可用洗板(ban)機洗板(ban)）。

6.每孔加入底(di)物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每(mei)孔(kong)加入終(zhong)止液50μL，15min內，在(zai)450nm波長處測定各(ge)孔(kong)的OD值。

實驗結果計算

以所測標(biao)準(zhun)品(pin)的OD值(zhi)為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標(biao)，在(zai)坐標(biao)紙上或(huo)用相關軟件繪制標(biao)準曲線，并得到直(zhi)線回歸方(fang)程，將樣品(pin)的(de)OD值(zhi)代入方程，計算(suan)出樣品(pin)的濃度。

試(shi)劑盒性能(neng)

1、檢測范圍：詳(xiang)見(jian)產品說明書。

2、靈(ling)敏度(du)：最di檢(jian)測濃度小于0.1 U/L。

3、特異性：不與其它可溶性結構(gou)類似(si)物(wu)交叉反應(ying)。

4、重復性：板內(nei)變異系(xi)數小(xiao)于10% ，板間(jian)變異系數小于(yu)15% 。