人過氧化(hua)脂(zhi)質(zhi)(LPO）ELISA試(shi)劑盒課題研究

人過(guo)氧化脂(zhi)質(LPO）ELISA試劑(ji)盒(he)實驗原理

人過氧化脂(zhi)質(LPO）ELISA試劑(ji)盒采用雙抗體一步夾心法(fa)酶聯(lian)免疫(yi)吸附試驗(yan)（ELISA）。往預先包被人過氧化脂質(LPO）捕獲抗(kang)體(ti)的包(bao)被微孔中，依次加入(ru)標本、標準品、HRP標記的檢測(ce)抗體(ti)，經過溫育并徹(che)di洗滌。用底物TMB顯色(se)，TMB在過(guo)氧化(hua)物(wu)酶的(de)(de)催化(hua)下轉(zhuan)化(hua)成藍(lan)色(se)，并在酸的(de)(de)作用下轉(zhuan)化(hua)成最(zui)終的(de)(de)黃色(se)。顏色(se)的(de)(de)深(shen)淺和樣品中的(de)(de)人過氧(yang)化(hua)脂質(LPO）呈正相關。用(yong)酶標儀在450nm 波長下測定吸光(guang)度（OD 值(zhi)），計算(suan)樣品濃度。

樣本處(chu)理及(ji)要求

1.  血清：將收集于血清(qing)分(fen)離管的全血標(biao)本在室溫放置2小(xiao)時或(huo)(huo)4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上(shang)(shang)清即可，或(huo)(huo)將上(shang)(shang)清置(zhi)于(yu)-20℃或(huo)(huo)-80℃保存，但應避免反復(fu)凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集(ji)標本(ben)，并將標本(ben)在采集(ji)后的(de)30分(fen)鐘內(nei)于2-8℃ 1000×g離心15分(fen)鐘，取上清即可(ke)檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免反復凍融。
3. 組(zu)織(zhi)勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留(liu)血液（勻漿中裂(lie)解(jie)的(de)紅細胞會影響測(ce)量結果(guo)），稱重后將(jiang)組織剪碎(sui)。將(jiang)剪碎(sui)的(de)組織與(yu)對(dui)應體(ti)(ti)積(ji)的(de)PBS（一般按1:9的(de)重量體(ti)(ti)積(ji)比，比如1g的(de)組織樣品(pin)對(dui)應9mL的(de)PBS，具體(ti)(ti)體(ti)(ti)積(ji)可根據(ju)實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑(yi)制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充(chong)分研磨。為了進(jin)一步裂(lie)解(jie)組織細胞，可以對(dui)勻漿液進(jin)行超聲破碎(sui)，或反復凍(dong)融。最后將(jiang)勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢(jian)測(ce)。

4. 細胞(bao)培養物(wu)上清(qing)或其它生物(wu)標本：請1000×g離心20分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清即(ji)可檢測，或(huo)將上(shang)清置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反(fan)復凍(dong)融。

注：標本溶(rong)血會影響(xiang)最后檢測結果，因(yin)此(ci)溶(rong)血標本不宜進行此(ci)項檢測。

需要而未提(ti)供的試劑盒器材

1.酶標儀（450nm）

2.高(gao)精度加樣(yang)器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去(qu)離子水

備注：

1、標準品濃度依(yi)次為：詳見說明書；

2、經過大量(liang)正(zheng)常(chang)標(biao)(biao)本(ben)檢(jian)驗，標(biao)(biao)本(ben)的(de)正(zheng)常(chang)濃度值均在試劑盒提供的(de)檢(jian)測(ce)范圍(wei)內，實驗過程(cheng)中(zhong)直接取50μL樣(yang)(yang)(yang)本(ben)上樣(yang)(yang)(yang)即(ji)可。當(dang)有部分(fen)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)值超過最大(da)標準品(pin)濃度時，可用樣(yang)(yang)(yang)本(ben)稀釋液將標本(ben)進行適當(dang)稀釋后再進行實驗(yan)。

注意事項

1、嚴格按照規定(ding)的時間和溫度進行溫育以保(bao)證準(zhun)確結果。所有試劑(ji)都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑(ji)。

2、洗板不正確(que)(que)可以導致不準確(que)(que)的結(jie)果。在加入底物前確(que)(que)保盡(jin)量吸干孔內(nei)液體。溫育(yu)過程中(zhong)不要讓微孔干燥掉。

3、消除板(ban)底殘留(liu)的液體(ti)和手指印(yin)，否則影響OD值。

4、底(di)物顯色(se)(se)液應呈無色(se)(se)或很(hen)淺的顏色(se)(se)，已經(jing)變(bian)藍(lan)的底(di)物液不(bu)能使用。

5、避免試(shi)劑(ji)和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6、在儲(chu)存(cun)和溫育時避免(mian)強光(guang)直接照射。

7、平衡至室溫后(hou)再打開密封袋(dai)以防水(shui)滴(di)凝聚在(zai)冷(leng)板(ban)條(tiao)上。

8、任何(he)反(fan)應(ying)試劑(ji)不能接觸漂(piao)白溶劑(ji)或漂(piao)白溶劑(ji)所散發的強烈氣(qi)體。任何(he)漂(piao)白成分都(dou)會破壞試劑(ji)盒(he)中反(fan)應(ying)試劑(ji)的生(sheng)物(wu)活性。

9、不能使(shi)用過期產品。

10、如(ru)果(guo)可能傳播疾病，所有的樣品都應管理(li)好，按照規定(ding)的程序處(chu)理(li)樣品和(he)檢測(ce)裝置。

試劑準備

試(shi)劑盒從冷藏(zang)環境中取(qu)出應在(zai)室(shi)溫平(ping)衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的(de)稀(xi)釋：蒸餾水按1：20稀(xi)釋，即1份20×洗滌(di)緩(huan)沖液加19份(fen)蒸餾水。

操作步驟

1.從室(shi)溫平衡20min后的鋁箔袋中取(qu)出所需板(ban)條，剩(sheng)余(yu)板(ban)條用(yong)自封(feng)袋密封(feng)放回(hui)4℃。

2. 設置(zhi)標(biao)準(zhun)品孔(kong)和樣本孔(kong)，標(biao)準(zhun)品孔(kong)各加(jia)不同濃度(du)的標(biao)準(zhun)品50μL；

3.樣本(ben)孔中加入(ru)待(dai)測(ce)樣本(ben)50μL；空(kong)白(bai)孔不加(jia)。

4. 除(chu)空白孔(kong)(kong)外，標(biao)準品孔(kong)(kong)和樣(yang)本孔(kong)(kong)中每孔(kong)(kong)加入(ru)辣根過氧(yang)化物酶(mei)（HRP）標記(ji)的檢測(ce)抗(kang)體100μL，用封板(ban)膜封住反應(ying)孔，37℃水(shui)浴鍋或恒溫(wen)箱溫(wen)育(yu)60min。

5. 棄去液(ye)體(ti)，吸水紙上拍干(gan)，每孔(kong)加滿洗(xi)滌液(ye)（350μL），靜置1min，甩(shuai)去洗滌液，吸水紙(zhi)上(shang)拍干，如此重復(fu)洗板5次（也可用(yong)洗板(ban)機洗板(ban)）。

6.每孔(kong)加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每(mei)孔(kong)加入終止液(ye)50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔(kong)的OD值。

實(shi)驗結果計(ji)算(suan)

以所測標準品的OD值為(wei)橫(heng)坐(zuo)標(biao)，標(biao)準品的濃度值為(wei)縱坐(zuo)(zuo)標，在坐(zuo)(zuo)標紙上或用(yong)相關(guan)軟件繪制(zhi)標準曲線(xian)，并得(de)到直線回歸(gui)方程，將樣品(pin)的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

1、檢測(ce)范圍：詳見產(chan)品說明(ming)書。

2、靈敏度：最di檢測濃度小于0.1 U/L。

3、特(te)異性(xing)：不與其它可溶性(xing)結構類(lei)似物交叉反應。

4、重復性：板內變(bian)異系數小于10% ，板間變異系數(shu)小(xiao)于15% 。