人含SET域4(setd4）ELISA試劑盒(he)課題(ti)研(yan)究

人含SET域4(setd4）ELISA試劑盒實驗原理

人(ren)含SET域(yu)4(setd4）ELISA試劑盒(he)采用(yong)雙抗體(ti)一(yi)步夾心(xin)法酶(mei)聯(lian)免疫吸附試驗(yan)（ELISA）。往(wang)預先包被人(ren)含(han)SET域4(setd4）捕(bu)獲抗體的包被微孔中，依(yi)次(ci)加入(ru)標本(ben)、標準品、HRP標記的(de)檢(jian)測抗(kang)體，經過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色(se)，TMB在(zai)過氧化物酶的(de)催(cui)化下(xia)轉化成藍色(se)，并在(zai)酸(suan)的(de)作(zuo)用下(xia)轉化成最終的(de)黃(huang)色(se)。顏色(se)的(de)深淺和樣品中(zhong)的(de)人含SET域4(setd4）呈正(zheng)相(xiang)關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光(guang)度（OD 值），計算(suan)樣品濃度。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于血清(qing)分離管的全血標(biao)本(ben)在(zai)室溫放置(zhi)2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清(qing)即(ji)可，或將上清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但(dan)應避(bi)免反復凍融。
2.  血漿：用EDTA或(huo)肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在(zai)采集后的30分鐘(zhong)(zhong)內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘(zhong)(zhong)，取上(shang)(shang)清(qing)即可檢測，或(huo)將上(shang)(shang)清(qing)置于-20℃或(huo)-80℃保(bao)存，但應避(bi)免反復(fu)凍融。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組(zu)(zu)織(zhi)，去除(chu)殘(can)留血(xue)液（勻(yun)漿(jiang)中(zhong)(zhong)裂(lie)解的(de)紅(hong)細胞會影響測量(liang)結果），稱重(zhong)后將(jiang)組(zu)(zu)織(zhi)剪碎。將(jiang)剪碎的(de)組(zu)(zu)織(zhi)與對(dui)(dui)應體(ti)(ti)積(ji)(ji)的(de)PBS（一般按1:9的(de)重(zhong)量(liang)體(ti)(ti)積(ji)(ji)比，比如1g的(de)組(zu)(zu)織(zhi)樣品(pin)對(dui)(dui)應9mL的(de)PBS，具體(ti)(ti)體(ti)(ti)積(ji)(ji)可根(gen)據(ju)實驗需(xu)要適當(dang)調整，并做好記錄。推薦在(zai)PBS中(zhong)(zhong)加入(ru)蛋白(bai)酶抑制劑）加入(ru)玻璃勻(yun)漿(jiang)器(qi)中(zhong)(zhong)，于(yu)冰(bing)上(shang)充分(fen)研磨(mo)。為了進一步裂(lie)解組(zu)(zu)織(zhi)細胞，可以對(dui)(dui)勻(yun)漿(jiang)液進行超聲(sheng)破碎，或(huo)反復凍融。最后將(jiang)勻(yun)漿(jiang)液于(yu)5000×g離心(xin)5~10分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清檢測。

4. 細胞培養物(wu)上清或其它生物(wu)標(biao)本：請1000×g離心20分鐘(zhong)，取(qu)上清(qing)即可檢(jian)測，或將上清(qing)置于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反復(fu)凍融(rong)。

注：標本溶血(xue)會(hui)影響最后檢測結果，因此溶血(xue)標本不宜進(jin)行此項檢測。

需要而未提(ti)供的試劑(ji)盒器材

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水(shui)或去離子(zi)水(shui)

備注：

1、標準品(pin)濃(nong)度依次為(wei)：詳見說明書；

2、經過大量正常標(biao)本檢驗(yan)，標(biao)本的正常濃度值均(jun)在試(shi)劑盒(he)提供的檢測范圍內(nei)，實驗(yan)過程(cheng)中(zhong)直接取(qu)50μL樣(yang)本上樣(yang)即可。當有(you)部分樣(yang)本值(zhi)超(chao)過最(zui)大標(biao)準品濃度時，可用樣(yang)本稀釋(shi)液將標(biao)本進(jin)行適當稀釋(shi)后(hou)再進(jin)行實驗。

注意事項

1、嚴格按照規定的時間和溫度(du)進行溫育以保證準確結果(guo)。所有試劑都必須在使用前(qian)達到室溫20-25℃。使用后立即(ji)冷(leng)藏保存試劑。

2、洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入(ru)底物前確保盡量吸(xi)干孔內液體。溫育過程中不要(yao)讓(rang)微孔干燥掉。

3、消除板底殘留(liu)的液體和手指印，否則影響OD值。

4、底物(wu)顯色(se)液(ye)應呈無色(se)或很淺的顏色(se)，已(yi)經變(bian)藍的底物(wu)液(ye)不(bu)能使用。

5、避免試劑(ji)和標本(ben)的交(jiao)叉污染以(yi)免造成(cheng)錯誤結(jie)果。

6、在儲存和(he)溫育時避免(mian)強光(guang)直接照射。

7、平衡至室溫后再打開密(mi)封(feng)袋以(yi)防水(shui)滴凝聚(ju)在冷板條上(shang)。

8、任何反應(ying)試(shi)劑不能接觸漂白溶(rong)劑或漂白溶(rong)劑所散(san)發(fa)的(de)強烈氣(qi)體。任何漂白成分都會破壞試(shi)劑盒中反應(ying)試(shi)劑的(de)生(sheng)物活性。

9、不能使用過(guo)期產品。

10、如果可能傳播疾病，所有的(de)樣(yang)品都應(ying)管理(li)好，按照規定的(de)程序處理(li)樣(yang)品和檢測裝置。

試劑準備

試(shi)劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液(ye)的稀釋(shi)：蒸(zheng)餾水按1：20稀釋，即1份20×洗(xi)滌緩沖液加19份(fen)蒸餾水。

操作步驟

1.從室(shi)溫平衡20min后的鋁箔(bo)袋(dai)中取出所需(xu)板條，剩余(yu)板條用(yong)自封袋(dai)密封放回(hui)4℃。

2. 設置標(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)和樣本孔(kong)，標(biao)準(zhun)品(pin)孔(kong)各加不同(tong)濃度的標(biao)準(zhun)品(pin)50μL；

3.樣本(ben)孔中加入待(dai)測樣本50μL；空白孔不加。

4. 除(chu)空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加(jia)入辣(la)根(gen)過氧(yang)化(hua)物酶(mei)（HRP）標記的檢(jian)測抗體(ti)100μL，用(yong)封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋(guo)或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去(qu)液體(ti)，吸(xi)水紙上拍(pai)干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜(jing)置1min，甩(shuai)去洗滌液，吸水紙上(shang)拍(pai)干(gan)，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底(di)物A、B各50μL，37℃避(bi)光(guang)孵(fu)育15min。

7.每(mei)孔(kong)加入終止液(ye)50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計(ji)算

以所測標準品(pin)的(de)OD值為(wei)橫坐標(biao)，標(biao)準品的濃度值為縱坐(zuo)標，在(zai)坐(zuo)標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并(bing)得到直線回歸方程(cheng)，將(jiang)樣品的OD值代(dai)入方程(cheng)，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能(neng)

1、檢(jian)測范圍：詳(xiang)見(jian)產品說明書。

2、靈敏(min)度：最di檢測濃度(du)小于(yu)0.1 U/L。

3、特異(yi)性：不(bu)與其(qi)它可溶性結構類(lei)似物交叉反應。

4、重(zhong)復性(xing)：板內(nei)變異系數(shu)小于10% ，板(ban)間變異系數小于15% 。