人核糖體(ti)蛋白S25(RPS25）ELISA試劑盒課題研究

人(ren)核糖體蛋白S25(RPS25）ELISA試(shi)劑(ji)盒實驗原理

人核糖體蛋白S25(RPS25）ELISA試劑盒采用雙抗(kang)體一(yi)步(bu)夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包(bao)被人核糖體蛋白S25(RPS25）捕獲抗體的包被微孔(kong)中(zhong)，依次加入標(biao)本、標(biao)準品、HRP標記的檢測抗(kang)體(ti)，經(jing)過(guo)溫育并徹di洗滌。用(yong)底物TMB顯(xian)色(se)，TMB在過氧化物酶的(de)(de)(de)催化下(xia)轉化成藍(lan)色(se)，并在酸的(de)(de)(de)作(zuo)用下(xia)轉化成最終的(de)(de)(de)黃(huang)色(se)。顏色(se)的(de)(de)(de)深淺和樣品中的(de)(de)(de)人核(he)糖體蛋(dan)白S25(RPS25）呈正相(xiang)關。用酶(mei)標儀在450nm 波長下(xia)測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣本處理及要(yao)求

1.  血(xue)清：將收集于血(xue)清分離(li)管的全血(xue)標本在室溫放(fang)置(zhi)2小(xiao)時或4℃過夜，然后(hou)1000×g離(li)心20 分鐘，取上清即可(ke)，或將上清置于(yu)-20℃或-80℃保存，但應避免反復(fu)凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集(ji)標本，并將標本在采集(ji)后的30分(fen)鐘(zhong)內于2-8℃ 1000×g離(li)心15分(fen)鐘(zhong)，取上清即可檢測(ce)，或將上清置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但應避免(mian)反復凍融。
3. 組織勻漿：用預(yu)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織(zhi)，去(qu)除殘留血(xue)液(ye)（勻漿(jiang)中裂解的(de)紅細胞(bao)會影(ying)響(xiang)測(ce)量結(jie)果），稱重(zhong)后將組織(zhi)剪碎。將剪碎的(de)組織(zhi)與對(dui)應(ying)體(ti)積(ji)的(de)PBS（一般按1:9的(de)重(zhong)量體(ti)積(ji)比，比如1g的(de)組織(zhi)樣品(pin)對(dui)應(ying)9mL的(de)PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可(ke)根據實驗需要適當(dang)調(diao)整，并做(zuo)好記錄。推薦(jian)在PBS中加入蛋白(bai)酶抑制劑(ji)）加入玻璃勻漿(jiang)器中，于冰上(shang)充分(fen)研磨。為了進一步(bu)裂解組織(zhi)細胞(bao)，可(ke)以對(dui)勻漿(jiang)液(ye)進行超聲破碎，或反復凍(dong)融。最后將勻漿(jiang)液(ye)于5000×g離心5~10分(fen)鐘，取上(shang)清(qing)檢測(ce)。

4. 細胞培養(yang)物上清(qing)或其它生物標本：請1000×g離心(xin)20分(fen)鐘，取(qu)上清(qing)即可檢測，或將上清(qing)置于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反復凍融。

注：標(biao)本溶血(xue)會(hui)影響最后檢測結(jie)果，因(yin)此溶血(xue)標(biao)本不(bu)宜進(jin)行此項(xiang)檢測。

需要(yao)而未提供的試劑盒器材

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣(yang)器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱(xiang)

4.蒸(zheng)餾水或去離子(zi)水

備注：

1、標準品濃度依次為：詳(xiang)見說(shuo)明書；

2、經過(guo)大量正(zheng)(zheng)常標本檢(jian)驗，標本的正(zheng)(zheng)常濃(nong)度(du)值均在試(shi)劑盒提供(gong)的檢(jian)測(ce)范圍內，實驗過(guo)程(cheng)中直接取50μL樣(yang)(yang)本(ben)上(shang)樣(yang)(yang)即可。當有部(bu)分(fen)樣(yang)(yang)本(ben)值超過最大(da)標準品濃度時，可用樣(yang)(yang)本(ben)稀釋(shi)液(ye)將標本(ben)進(jin)行(xing)適(shi)當稀釋(shi)后再(zai)進(jin)行(xing)實驗。

注意事項

1、嚴格(ge)按(an)照(zhao)規定的時間和溫度進行溫育以保證(zheng)準確結果。所有試(shi)劑(ji)都必(bi)須在使用前(qian)達到室(shi)溫20-25℃。使用(yong)后立(li)即(ji)冷藏保存試劑。

2、洗板不正確可以導致不準(zhun)確的結果(guo)。在(zai)加入底物前確保盡量吸干孔內液體(ti)(ti)。溫(wen)育(yu)過程中不要讓微(wei)孔干燥掉(diao)。

3、消除(chu)板底殘(can)留的液體和手(shou)指印，否則影響OD值。

4、底物顯色(se)液應呈無色(se)或(huo)很淺(qian)的(de)顏色(se)，已經變藍(lan)的(de)底物液不能使用。

5、避免試劑和標(biao)本的交叉污染以(yi)免造成錯誤結果(guo)。

6、在儲存和溫育時(shi)避免(mian)強光(guang)直接照射。

7、平(ping)衡至室溫后(hou)再打開密封袋(dai)以防水滴凝聚(ju)在冷板條上(shang)。

8、任(ren)何反應(ying)試劑(ji)(ji)不(bu)能接觸(chu)漂(piao)白溶劑(ji)(ji)或漂(piao)白溶劑(ji)(ji)所散發的(de)強烈氣(qi)體。任(ren)何漂(piao)白成(cheng)分都會破壞(huai)試劑(ji)(ji)盒中反應(ying)試劑(ji)(ji)的(de)生物活(huo)性(xing)。

9、不能(neng)使用過期產品(pin)。

10、如(ru)果(guo)可能傳播疾病(bing)，所(suo)有(you)的樣品(pin)都應管(guan)理好(hao)，按照規定的程序處(chu)理樣品(pin)和檢測裝(zhuang)置。

試劑準備

試(shi)劑盒從冷藏環(huan)境中取出應(ying)在室(shi)溫平衡后(hou)方可使(shi)用。

20×洗滌緩沖液的稀(xi)釋(shi)：蒸(zheng)餾水按1：20稀釋(shi)，即1份(fen)20×洗滌緩沖液加19份蒸(zheng)餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡20min后的(de)鋁箔袋中取出所(suo)需板(ban)條，剩余板(ban)條用自封(feng)袋密封(feng)放回4℃。

2. 設置標準(zhun)品(pin)孔(kong)(kong)(kong)和(he)樣本孔(kong)(kong)(kong)，標準(zhun)品(pin)孔(kong)(kong)(kong)各(ge)加不同濃度(du)的標準(zhun)品(pin)50μL；

3.樣本孔中加入待測(ce)樣本50μL；空(kong)白孔(kong)不加。

4. 除空(kong)白孔外，標準品孔和(he)樣本孔中每孔加入(ru)辣(la)根過(guo)氧化物酶（HRP）標記的(de)檢測(ce)抗(kang)體100μL，用封(feng)板(ban)膜(mo)封(feng)住反應孔，37℃水浴鍋或恒(heng)溫箱溫育60min。

5. 棄(qi)去液體，吸(xi)水紙上拍干，每孔(kong)加(jia)滿洗滌(di)液（350μL），靜置1min，甩去洗滌(di)液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用(yong)洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避(bi)光(guang)孵育15min。

7.每(mei)孔加入(ru)終(zhong)止(zhi)液50μL，15min內，在450nm波(bo)長處測(ce)定各(ge)孔的OD值(zhi)。

實(shi)驗結果計算

以(yi)所測標準品(pin)的OD值為橫(heng)坐標，標(biao)準品(pin)的濃度(du)值(zhi)為(wei)縱坐(zuo)標，在坐(zuo)標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程(cheng)，將(jiang)樣品的OD值(zhi)代入方程，計(ji)算出樣品的濃度。

試(shi)劑盒性能(neng)

1、檢測范圍(wei)：詳見產(chan)品(pin)說明書。

2、靈敏度：最di檢測濃度小于0.1 U/L。

3、特(te)異性(xing)：不(bu)與其它可溶性(xing)結構類(lei)似物交叉反應。

4、重復性：板(ban)內(nei)變異系數小于(yu)10% ，板間變異系數小于15% 。