人神經絲蛋白L（NF-L）ELISA試(shi)劑盒(he)操(cao)作說明(ming)

人神經絲蛋白L（NF-L）ELISA試劑盒實驗原理

人神經絲蛋白L（NF-L）試(shi)劑盒采(cai)用雙抗體一步(bu)夾心法(fa)酶聯免(mian)疫吸附(fu)試(shi)驗（ELISA）。往(wang)預先包被人神經(jing)絲蛋白L（NF-L）捕獲抗(kang)體的包被微孔中，依次加(jia)入標本、標準品(pin)、HRP標記(ji)的檢測抗(kang)體，經(jing)過(guo)溫育并*洗滌。用(yong)底物TMB顯色(se)，TMB在過(guo)氧(yang)化(hua)(hua)(hua)物酶(mei)的催化(hua)(hua)(hua)下轉化(hua)(hua)(hua)成藍(lan)色(se)，并在酸的作用(yong)下轉化(hua)(hua)(hua)成終的黃色(se)。顏色(se)的深淺和(he)樣(yang)品(pin)中的人神(shen)經(jing)絲蛋(dan)白L（NF-L）呈(cheng)正相關。用酶標儀在(zai)450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算(suan)樣品(pin)濃(nong)度。

樣本處理(li)及要(yao)求

1.  血清(qing)：將收集于血(xue)清分離管的全血(xue)標(biao)本在室(shi)溫放置(zhi)2小(xiao)時或4℃過夜，然(ran)后1000×g離心(xin)20 分鐘，取(qu)上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反(fan)復凍融。
2.  血漿：用EDTA或(huo)肝素作為抗凝劑采集(ji)標本(ben)，并(bing)將標本(ben)在采集(ji)后的30分鐘(zhong)內(nei)于2-8℃ 1000×g離(li)心(xin)15分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清即(ji)可檢測，或將上(shang)清置于-20℃或-80℃保存，但應(ying)避免反復凍融(rong)。
3.  組織(zhi)勻漿：用(yong)預冷(leng)的(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)織，去除殘留血液（勻(yun)(yun)漿(jiang)中裂(lie)解的(de)(de)紅細(xi)胞會影響測量(liang)結(jie)果），稱重后將組(zu)織剪碎(sui)。將剪碎(sui)的(de)(de)組(zu)織與對(dui)應體積(ji)的(de)(de)PBS（一(yi)般按1:9的(de)(de)重量(liang)體積(ji)比，比如1g的(de)(de)組(zu)織樣品(pin)對(dui)應9mL的(de)(de)PBS，具體體積(ji)可根據實(shi)驗需要(yao)適(shi)當(dang)調整，并(bing)做好記錄(lu)。推(tui)薦在PBS中加(jia)入蛋(dan)白(bai)酶抑制劑(ji)）加(jia)入玻璃勻(yun)(yun)漿(jiang)器(qi)中，于冰上充分研磨。為了(le)進(jin)一(yi)步裂(lie)解組(zu)織細(xi)胞，可以(yi)對(dui)勻(yun)(yun)漿(jiang)液進(jin)行超聲破碎(sui)，或反復凍(dong)融。后將勻(yun)(yun)漿(jiang)液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.  細胞培(pei)養物(wu)上清或(huo)其它(ta)生物(wu)標本：請1000×g離心(xin)20分鐘，取上清即(ji)可檢測，或將上清置于(yu)-20℃或-80℃保(bao)存(cun)，但(dan)應(ying)避免反復凍融。

注：標本溶血(xue)(xue)會影響(xiang)后檢測(ce)結(jie)果，因(yin)此溶血(xue)(xue)標本不(bu)宜進行(xing)此項檢測(ce)。

需要而未(wei)提(ti)供(gong)的(de)試(shi)劑盒(he)器(qi)材

1.酶(mei)標(biao)儀(yi)（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

人神經絲蛋白(bai)L（NF-L）ELISA試劑盒(he)組成

備(bei)注：

1、標準品(pin)濃(nong)度依次為：800、400、200、100、50、25 ng/ml

2、經過(guo)大量正常標本檢驗(yan)，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實驗(yan)過(guo)程(cheng)中直接取(qu)50μL樣(yang)本(ben)上樣(yang)即(ji)可。當(dang)有(you)部分樣(yang)本(ben)值超(chao)過大標準品(pin)濃度時，可用樣(yang)本(ben)稀釋液將標本(ben)進(jin)行(xing)適當(dang)稀釋后(hou)再(zai)進(jin)行(xing)實驗。

注意事項

1、嚴格(ge)按照規定的時(shi)間和溫度進(jin)行溫育以(yi)保證準確結果。所有試劑(ji)都(dou)必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即(ji)冷藏(zang)保存試劑(ji)。

2、洗(xi)板(ban)不(bu)正(zheng)確可以導致不(bu)準確的(de)結果。在加入底物前確保盡量吸干(gan)孔內(nei)液體(ti)。溫(wen)育(yu)過程中不(bu)要(yao)讓微孔干(gan)燥掉。

3、消除板底(di)殘留的(de)液體和手指印(yin)，否則影響OD值。

4、底(di)物(wu)顯色(se)液應呈(cheng)無色(se)或很淺的(de)顏色(se)，已(yi)經變藍(lan)的(de)底(di)物(wu)液不能使用。

5、避免(mian)試劑和標本的交叉污染以免(mian)造成錯誤結果。

6、在儲存和溫育時避(bi)免強光直(zhi)接照射。

7、平衡至室溫后再打開(kai)密封(feng)袋以防(fang)水滴凝聚在冷板條上。

8、任何反應(ying)試劑(ji)不能接觸漂白(bai)溶劑(ji)或漂白(bai)溶劑(ji)所散發(fa)的(de)強烈氣體。任何漂白(bai)成分都(dou)會破壞試劑(ji)盒中反應(ying)試劑(ji)的(de)生(sheng)物活性(xing)。

9、不能使(shi)用過期產(chan)品。

10、如果可(ke)能傳播疾病(bing)，所有(you)的樣品(pin)都應管理(li)好(hao)，按照規定(ding)的程序處理(li)樣品(pin)和檢測(ce)裝置。

試(shi)劑準備(bei)

試劑盒(he)從冷藏環(huan)境中取出應在(zai)室溫平衡后方(fang)可使(shi)用。

20×洗(xi)(xi)滌(di)緩沖液的稀釋：蒸(zheng)餾水按1：20稀釋，即1份20×洗(xi)(xi)滌(di)緩沖液加19份蒸(zheng)餾水。

操作步驟

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出(chu)所需板條(tiao)，剩余(yu)板條(tiao)用自(zi)封(feng)(feng)袋密(mi)封(feng)(feng)放回4℃。

2. 設(she)置標準品孔和樣(yang)本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.樣本孔(kong)中加入(ru)待測樣本(ben)50μL；空白孔不加。

4. 除空白孔(kong)(kong)外，標準品孔(kong)(kong)和樣本孔(kong)(kong)中每孔(kong)(kong)加入辣根(gen)過氧化(hua)物(wu)酶（HRP）標記(ji)的檢測抗(kang)體100μL，用封(feng)板膜封(feng)住反應孔(kong)(kong)，37℃水浴鍋(guo)或恒溫箱(xiang)溫育60min。

5. 棄去液(ye)體，吸水紙上(shang)拍干(gan)，每(mei)孔加(jia)滿(man)洗滌液(ye)（350μL），靜置1min，甩(shuai)去洗滌(di)液(ye)，吸水紙(zhi)上拍干，如(ru)此(ci)重復(fu)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔(kong)加入底物(wu)A、B各(ge)50μL，37℃避光孵(fu)育15min。

7.每孔(kong)加入(ru)終止液50μL，15min內，在450nm波長(chang)處(chu)測定各(ge)孔(kong)的OD值。

實驗結果計算

以所測標(biao)準品的OD值為橫坐標(biao)，標準品的濃度值為縱坐標(biao)，在(zai)坐標(biao)紙(zhi)上或用相關軟件(jian)繪(hui)制(zhi)標(biao)準曲線(xian)，并得(de)到(dao)直線回歸方(fang)程，將樣品(pin)的OD值代入方程，計算出(chu)樣品(pin)的濃(nong)度(du)。

試劑盒性(xing)能

1、檢(jian)測范(fan)圍：25 ng/ml – 800 ng/ml。

2、靈敏度：低檢測濃度小于1.0 ng/mL。

3、特(te)異性：不與(yu)其它可溶性結構類似物(wu)交叉反應。

4、重復性：板內變異系數(shu)小于(yu)10% ，板間變異系數小于(yu)15% 。