豬流行性(xing)腹瀉病毒（PEDV）ELISA試劑盒說明(ming)書

豬流(liu)行性腹瀉病(bing)毒(du)（PEDV）ELISA試劑盒(he)實(shi)驗原理

豬(zhu)流行性(xing)腹瀉病毒（PEDV）試劑(ji)盒(he)采用雙抗(kang)體一(yi)步(bu)夾心法酶聯(lian)免疫吸附試驗(yan)（ELISA）。往預(yu)先包被豬(zhu)流行性腹瀉病(bing)毒（PEDV）捕獲抗(kang)體的(de)包被(bei)微(wei)孔中(zhong)，依次加入標(biao)本、標(biao)準品、HRP標(biao)記的(de)檢測抗(kang)體，經過(guo)溫育并*洗滌(di)。用底物(wu)TMB顯色，TMB在過(guo)氧化物(wu)酶的(de)催化下轉化成(cheng)藍色，并在酸(suan)的(de)作用下轉化成(cheng)終的(de)黃色。顏色的(de)深淺和(he)樣品中(zhong)的(de)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）呈正相關(guan)。用酶標儀在450nm 波長下(xia)測定吸光(guang)度（OD 值(zhi)），計算(suan)樣品(pin)濃度。

樣(yang)本處理(li)及要求

1.  血清：將收集于血清分(fen)離(li)管的全血標(biao)本(ben)在室溫放置(zhi)2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上(shang)(shang)清即(ji)可(ke)，或(huo)將上(shang)(shang)清置于(yu)-20℃或-80℃保存(cun)，但應避免反復凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素(su)作為(wei)抗凝(ning)劑采集(ji)標本，并將(jiang)標本在采集(ji)后的30分(fen)鐘內(nei)于(yu)2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即(ji)可檢(jian)測，或將上清置于-20℃或-80℃保存(cun)，但(dan)應(ying)避免反復凍融。
3.  組織勻(yun)漿：用預冷的(de)(de)(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)(zu)(zu)(zu)織，去除殘留血液（勻(yun)漿(jiang)中裂(lie)解(jie)的(de)(de)(de)(de)紅細(xi)胞(bao)會影響測(ce)量結果），稱重后(hou)將(jiang)(jiang)組(zu)(zu)(zu)(zu)織剪碎。將(jiang)(jiang)剪碎的(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)(zu)(zu)織與對(dui)(dui)應體(ti)積(ji)的(de)(de)(de)(de)PBS（一般按1:9的(de)(de)(de)(de)重量體(ti)積(ji)比，比如(ru)1g的(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)(zu)(zu)織樣品(pin)對(dui)(dui)應9mL的(de)(de)(de)(de)PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可(ke)根據實(shi)驗需要(yao)適當調整，并做好(hao)記(ji)錄。推薦在(zai)PBS中加入(ru)(ru)蛋白酶抑制劑）加入(ru)(ru)玻璃勻(yun)漿(jiang)器(qi)中，于冰(bing)上充(chong)分研磨。為了進一步裂(lie)解(jie)組(zu)(zu)(zu)(zu)織細(xi)胞(bao)，可(ke)以對(dui)(dui)勻(yun)漿(jiang)液進行超聲破碎，或(huo)反復凍融(rong)。后(hou)將(jiang)(jiang)勻(yun)漿(jiang)液于5000×g離心5~10分鐘，取上清(qing)檢(jian)測(ce)。

4.  細胞培養物上清或其它生物標本：請1000×g離(li)心20分鐘，取上(shang)清即可檢測，或將上(shang)清置于-20℃或-80℃保(bao)存，但(dan)應避(bi)免反復(fu)凍(dong)融。

注：標本溶血(xue)會(hui)影響后檢測結果(guo)，因此溶血(xue)標本不(bu)宜進行此項檢測。

需要(yao)而未(wei)提供的試劑盒(he)器材

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍(qiang)頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾(liu)水或去離子水

豬流行(xing)性腹瀉病毒（PEDV）ELISA試劑盒(he)組成(cheng)

備(bei)注：

1、標準品(pin)濃度依次(ci)為(wei)：20、10、5、2.5、1.25、0.625 ng/ml

2、經過大(da)量正常標(biao)本(ben)檢驗，標(biao)本(ben)的正常濃度值(zhi)均在試劑(ji)盒提供的檢測(ce)范圍內，實驗過程中(zhong)直接(jie)取50μL樣本(ben)上(shang)樣即可。當有部分樣本(ben)值超過大標準品濃(nong)度時(shi)，可用(yong)樣本(ben)稀(xi)釋(shi)液將標本(ben)進行(xing)適當稀(xi)釋(shi)后再(zai)進行(xing)實驗。

注意事項

1、嚴格按照規定的時間和溫(wen)度進(jin)行溫(wen)育以保(bao)證準確結果。所有試劑(ji)都必須在使用前(qian)達到室溫(wen)20-25℃。使用后立即冷藏保(bao)存(cun)試劑(ji)。

2、洗板不正確可以(yi)導致不準確的結果。在(zai)加入(ru)底物前(qian)確保盡(jin)量(liang)吸干孔內液體(ti)。溫育過程(cheng)中不要讓(rang)微孔干燥掉。

3、消(xiao)除板底殘留的(de)液(ye)體和手指印(yin)，否則影響OD值。

4、底物(wu)顯色(se)液應呈無色(se)或很淺(qian)的顏色(se)，已(yi)經(jing)變藍的底物(wu)液不能使用。

5、避免(mian)試劑和(he)標本的交叉污染(ran)以免(mian)造成(cheng)錯誤(wu)結果。

6、在儲存和溫育時避(bi)免強光直接照(zhao)射。

7、平(ping)衡至(zhi)室(shi)溫后再打開(kai)密封(feng)袋以防(fang)水滴凝聚(ju)在冷板條(tiao)上。

8、任(ren)何反(fan)應(ying)試(shi)劑(ji)(ji)不能接(jie)觸漂(piao)白溶劑(ji)(ji)或漂(piao)白溶劑(ji)(ji)所散發的強烈氣體。任(ren)何漂(piao)白成分都會破壞試(shi)劑(ji)(ji)盒(he)中反(fan)應(ying)試(shi)劑(ji)(ji)的生物活性(xing)。

9、不能使(shi)用過期(qi)產品。

10、如果可能(neng)傳播疾病，所有的(de)樣品都(dou)應管理好，按照規定的(de)程序處(chu)理樣品和檢(jian)測裝置。

試(shi)劑準備

試劑盒(he)從冷藏環境中(zhong)取出應在室(shi)溫(wen)平衡后方可使用。

20×洗(xi)滌(di)(di)緩沖液的稀釋：蒸餾水按(an)1：20稀釋，即1份20×洗(xi)滌(di)(di)緩沖液加19份蒸餾水。

操(cao)作(zuo)步驟

1.從室溫平(ping)衡20min后的鋁箔袋中取出所(suo)需板(ban)條，剩余板(ban)條用自(zi)封(feng)袋密封(feng)放回4℃。

2. 設置標(biao)(biao)準(zhun)品孔和樣本孔，標(biao)(biao)準(zhun)品孔各加不同濃度的標(biao)(biao)準(zhun)品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣(yang)本50μL；空白(bai)孔不加。

4. 除(chu)空白孔外(wai)，標準品(pin)孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guo)氧化物酶（HRP）標記(ji)的檢測(ce)抗體100μL，用封(feng)板膜(mo)封(feng)住(zhu)反應(ying)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱(xiang)溫育60min。

5. 棄(qi)去液(ye)體(ti)，吸水紙上拍(pai)干，每孔加(jia)滿洗滌液(ye)（350μL），靜置1min，甩去(qu)洗滌液(ye)，吸(xi)水(shui)紙上拍干，如此重(zhong)復洗板(ban)5次(ci)（也可用洗板(ban)機(ji)洗板(ban)）。

6.每孔加入(ru)底物A、B各(ge)50μL，37℃避光孵育(yu)15min。

7.每孔(kong)加(jia)入(ru)終止(zhi)液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔(kong)的OD值。

實驗結(jie)果計算

以所測標準品的OD值為(wei)橫坐(zuo)標，標準(zhun)品的濃度值(zhi)為縱坐標(biao)(biao)，在坐標(biao)(biao)紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到(dao)直(zhi)線回歸方程，將樣(yang)品(pin)的OD值代入方程，計算出樣(yang)品(pin)的濃(nong)度。

試劑盒性(xing)能

1、檢(jian)測范圍(wei)：0.625 ng/ml – 20 ng/ml。

2、靈敏度(du)：低檢測濃度(du)小于0.1 ng/ml。

3、特異(yi)性：不與其它可溶(rong)性結構(gou)類似物交叉反應。

4、重(zhong)復性：板內(nei)變異系數小于(yu)10% ，板間變異系數小于15% 。