人胰島素（INS）ELISA試劑盒說(shuo)明(ming)書

人胰島素（INS）ELISA試劑盒實(shi)驗原理

人胰島素（INS）試劑盒(he)采用雙抗體一步夾(jia)心法酶聯免疫吸附(fu)試驗（ELISA）。往(wang)預先包被人胰島素（INS）捕(bu)獲抗體的(de)(de)(de)包被微孔中，依次加入標(biao)(biao)本、標(biao)(biao)準品、HRP標(biao)(biao)記的(de)(de)(de)檢測抗體，經(jing)過溫育并*洗滌。用(yong)底物TMB顯(xian)色(se)(se)，TMB在過氧化(hua)(hua)物酶(mei)的(de)(de)(de)催化(hua)(hua)下轉(zhuan)化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)藍色(se)(se)，并在酸的(de)(de)(de)作用(yong)下轉(zhuan)化(hua)(hua)成(cheng)(cheng)終的(de)(de)(de)黃色(se)(se)。顏色(se)(se)的(de)(de)(de)深淺(qian)和樣(yang)品中的(de)(de)(de)人胰島(dao)素(su)（INS）呈正相關。用酶標儀在450nm 波(bo)長(chang)下測定吸光度（OD 值(zhi)），計(ji)算樣(yang)品濃度。

樣本處理(li)及要求

1.  血清：將收集于血(xue)清分離(li)管的全血(xue)標(biao)本(ben)在室溫放(fang)置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心(xin)20 分鐘，取上清(qing)即可，或將上清(qing)置于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)。
2.  血漿(jiang)：用EDTA或肝素作為抗凝劑采(cai)(cai)集(ji)標(biao)本(ben)，并將標(biao)本(ben)在采(cai)(cai)集(ji)后的30分鐘內于(yu)2-8℃ 1000×g離(li)心15分鐘，取上(shang)(shang)清即可(ke)檢測，或將(jiang)上(shang)(shang)清置于(yu)-20℃或-80℃保存，但(dan)應(ying)避(bi)免反復凍融。
3.  組織勻漿：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)(zu)織，去除殘留血液(ye)（勻(yun)(yun)漿中裂解的(de)紅細胞會影響(xiang)測量(liang)結果），稱重(zhong)后將(jiang)組(zu)(zu)織剪(jian)碎(sui)。將(jiang)剪(jian)碎(sui)的(de)組(zu)(zu)織與(yu)對應(ying)(ying)體(ti)積(ji)的(de)PBS（一般按1:9的(de)重(zhong)量(liang)體(ti)積(ji)比，比如1g的(de)組(zu)(zu)織樣品對應(ying)(ying)9mL的(de)PBS，具(ju)體(ti)體(ti)積(ji)可根(gen)據(ju)實驗需要適當調整，并做好記錄(lu)。推薦(jian)在PBS中加入蛋白酶抑(yi)制劑）加入玻(bo)璃勻(yun)(yun)漿器中，于冰上充分(fen)研(yan)磨。為了(le)進一步(bu)裂解組(zu)(zu)織細胞，可以對勻(yun)(yun)漿液(ye)進行超聲(sheng)破(po)碎(sui)，或反(fan)復凍融。后將(jiang)勻(yun)(yun)漿液(ye)于5000×g離心(xin)5~10分(fen)鐘，取上清(qing)檢測。

4.  細(xi)胞培養物(wu)上清(qing)或其它生(sheng)物(wu)標本(ben)：請1000×g離(li)心20分鐘，取上清(qing)(qing)即可檢測，或將上清(qing)(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避免(mian)反復凍融。

注：標本溶(rong)血會影(ying)響后檢(jian)測(ce)結(jie)果，因(yin)此溶(rong)血標本不(bu)宜進(jin)行此項檢(jian)測(ce)。

需要而未提供的試(shi)劑(ji)盒器材

1.酶(mei)標儀(yi)（450nm）

2.高(gao)精度(du)加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸(zheng)餾水或去(qu)離子水

人胰(yi)島(dao)素（INS）ELISA試劑盒組成

備(bei)注：

1、標準品濃度依次(ci)為：32、16、8、4、2、1 mIU/L

2、經過(guo)大量(liang)正(zheng)常(chang)標本(ben)檢驗(yan)，標本(ben)的(de)正(zheng)常(chang)濃度值(zhi)均在(zai)試(shi)劑盒(he)提供(gong)的(de)檢測范圍內，實驗(yan)過(guo)程中直接取50μL樣(yang)(yang)本上樣(yang)(yang)即可(ke)。當有(you)部分樣(yang)(yang)本值(zhi)超過大標準(zhun)品(pin)濃度時，可(ke)用樣(yang)(yang)本稀釋(shi)液將標本進行適(shi)當稀釋(shi)后再進行實驗。

注意事項

1、嚴(yan)格按照(zhao)規定(ding)的時(shi)間和溫度(du)進行(xing)溫育(yu)以保(bao)證準確結果。所有試劑都必須在使(shi)用前(qian)達到室溫20-25℃。使(shi)用后立(li)即冷藏保(bao)存(cun)試劑。

2、洗板不(bu)正確可(ke)以導致不(bu)準確的結果(guo)。在加入底物(wu)前確保盡量吸(xi)干孔(kong)內液體。溫育過程中不(bu)要讓微孔(kong)干燥掉(diao)。

3、消(xiao)除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4、底物(wu)顯色(se)液應(ying)呈(cheng)無色(se)或很淺的(de)顏(yan)色(se)，已經變藍的(de)底物(wu)液不能使用(yong)。

5、避免(mian)試劑(ji)和標(biao)本的(de)交叉污染以免(mian)造成錯誤結果(guo)。

6、在儲存和(he)溫(wen)育(yu)時避免(mian)強光直接(jie)照(zhao)射。

7、平衡至室溫后再打開密封袋(dai)以防水滴凝聚在(zai)冷板條上。

8、任(ren)何反應試(shi)劑不能接觸(chu)漂(piao)白(bai)溶(rong)劑或漂(piao)白(bai)溶(rong)劑所散發(fa)的(de)強烈氣體。任(ren)何漂(piao)白(bai)成(cheng)分都會破壞試(shi)劑盒中反應試(shi)劑的(de)生物活性。

9、不能使(shi)用過期(qi)產品。

10、如果(guo)可能傳播疾病，所有的(de)樣(yang)品都應(ying)管理好，按照規定的(de)程(cheng)序處理樣(yang)品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從(cong)冷藏環(huan)境中取出(chu)應(ying)在室溫平衡后方可使用。

20×洗(xi)滌(di)緩(huan)沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗(xi)滌(di)緩(huan)沖液加19份蒸餾水。

操作(zuo)步驟

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取(qu)出(chu)所需板條(tiao)，剩余板條(tiao)用自(zi)封袋密封放回4℃。

2. 設置標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)孔和樣(yang)本(ben)孔，標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)孔各加不(bu)同濃度的標(biao)(biao)準(zhun)品(pin)50μL；

3.樣本孔中加(jia)入待(dai)測(ce)樣(yang)本50μL；空白孔不加。

4. 除空白孔(kong)外(wai)，標準品孔(kong)和樣本孔(kong)中每孔(kong)加入辣根(gen)過(guo)氧化物(wu)酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔(kong)，37℃水浴(yu)鍋或(huo)恒溫箱溫育60min。

5. 棄(qi)去液(ye)體，吸水紙上(shang)拍干，每孔加滿洗滌液(ye)（350μL），靜置1min，甩去(qu)洗(xi)(xi)滌(di)液，吸水紙上拍干，如此重復洗(xi)(xi)板(ban)5次（也可用(yong)洗(xi)(xi)板(ban)機洗(xi)(xi)板(ban)）。

6.每(mei)孔加入(ru)底物(wu)A、B各50μL，37℃避光孵育(yu)15min。

7.每孔加(jia)入終止(zhi)液50μL，15min內(nei)，在450nm波長處測(ce)定各孔的OD值。

實驗(yan)結果計算(suan)

以所(suo)測(ce)標準(zhun)品(pin)的OD值(zhi)為橫坐(zuo)標，標準品的濃度(du)值為縱坐標(biao)(biao)，在坐標(biao)(biao)紙(zhi)上或用相關軟件繪制(zhi)標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值(zhi)代入方(fang)程(cheng)，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

1、檢測(ce)范圍(wei)：1 mIU/L – 32 mIU/L。

2、靈敏度：低(di)檢(jian)測濃度小于(yu)0.1 mIU/L。

3、特異性：不與其它可溶(rong)性結構類似物交叉反應。

4、重復性(xing)：板內(nei)變異系數小于10% ，板間變異系數小(xiao)于15% 。