魚低密(mi)度脂蛋白(bai)受體（LDLR）ELISA試劑盒說明書(shu)

魚低(di)密度脂蛋(dan)白(bai)受體(ti)（LDLR）ELISA試(shi)劑(ji)盒實驗原理

魚低(di)密度(du)脂蛋白受(shou)體(ti)（LDLR）試劑(ji)盒采用雙抗體一(yi)步夾心法(fa)酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先(xian)包被魚低密度(du)脂蛋(dan)白受(shou)體（LDLR）捕獲抗(kang)體(ti)的(de)(de)包被微孔中，依次(ci)加入標本、標準品、HRP標記的(de)(de)檢測抗(kang)體(ti)，經過溫育并*洗滌(di)。用(yong)底物(wu)TMB顯色，TMB在(zai)過氧化物(wu)酶的(de)(de)催化下轉(zhuan)(zhuan)化成(cheng)藍色，并在(zai)酸(suan)的(de)(de)作用(yong)下轉(zhuan)(zhuan)化成(cheng)終的(de)(de)黃色。顏色的(de)(de)深淺和樣品中的(de)(de)魚低密度脂蛋白受體（LDLR）呈正相關。用(yong)酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣(yang)品濃度。

樣本處理及(ji)要求(qiu)

1.  血清：將收集于血(xue)清分離管(guan)的全血(xue)標本在室(shi)溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘(zhong)，取(qu)上清即可，或(huo)將上清置于-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但應避免反復(fu)凍融。
2.  血(xue)漿：用EDTA或肝素作為抗凝(ning)劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×;g離心15分鐘(zhong)，取(qu)上清(qing)即可檢測，或將(jiang)上清(qing)置于(yu)-20℃或-80℃保存，但應避免(mian)反復凍融。
3.  組(zu)織勻漿：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)(zu)織，去除殘留血液（勻(yun)漿(jiang)(jiang)中裂解的(de)紅細胞會(hui)影響測(ce)(ce)量結果(guo)），稱重后(hou)將組(zu)(zu)織剪碎。將剪碎的(de)組(zu)(zu)織與對應體(ti)積的(de)PBS（一般按1:9的(de)重量體(ti)積比(bi)，比(bi)如(ru)1g的(de)組(zu)(zu)織樣品對應9mL的(de)PBS，具(ju)體(ti)體(ti)積可(ke)根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦(jian)在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻(yun)漿(jiang)(jiang)器(qi)中，于(yu)冰上充分研磨。為了進一步(bu)裂解組(zu)(zu)織細胞，可(ke)以對勻(yun)漿(jiang)(jiang)液進行(xing)超聲破碎，或反復凍融。后(hou)將勻(yun)漿(jiang)(jiang)液于(yu)5000×g離心(xin)5~10分鐘，取(qu)上清檢測(ce)(ce)。

4.  細胞培養物(wu)上清或其(qi)它生(sheng)物(wu)標本(ben)：請(qing)1000×g離心20分鐘，取(qu)上(shang)清(qing)(qing)即可(ke)檢測(ce)，或將上(shang)清(qing)(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融(rong)。

注(zhu)：標本溶血會影響后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

需要(yao)而未提供的(de)試劑盒器材

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加(jia)樣(yang)器及槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒(heng)溫箱(xiang)

4.蒸餾水或(huo)去離(li)子(zi)水

魚低密度(du)脂蛋白受體（LDLR）ELISA試(shi)劑盒組成

備注：

1.  標準品濃度(du)依次為(wei)：8、4、2、1、0.5、0.25 mmol/L

2.  經過大量正常標(biao)本檢驗，標(biao)本的(de)正常濃度值均在試劑盒提供的(de)檢測范圍內，實驗過程(cheng)中直接取50μL樣本(ben)(ben)上樣即(ji)可。當(dang)有部分樣本(ben)(ben)值(zhi)超過(guo)大標(biao)準品(pin)濃度時，可用樣本(ben)(ben)稀釋液(ye)將標(biao)本(ben)(ben)進(jin)行適當(dang)稀釋后再進(jin)行實驗。

注意(yi)事項

1、嚴格按照規定的時(shi)間和溫度進行溫育以保證準確(que)結果。所有試劑(ji)都必須在使用(yong)前達(da)到室(shi)溫20-25℃。使用(yong)后立(li)即(ji)冷藏保存(cun)試劑(ji)。

2、洗板不(bu)(bu)正確(que)(que)可以(yi)導致不(bu)(bu)準(zhun)確(que)(que)的(de)結果。在加(jia)入底物前確(que)(que)保盡(jin)量(liang)吸(xi)干孔內液體。溫育過(guo)程(cheng)中不(bu)(bu)要讓微孔干燥掉。

3、消除(chu)板底殘留的(de)液體和手指(zhi)印，否則(ze)影響(xiang)OD值(zhi)。

4、底物顯色(se)液應呈無(wu)色(se)或很淺的顏色(se)，已經變藍的底物液不能使(shi)用。

5、避(bi)免試(shi)劑和標本的(de)交叉污染以免造成錯誤結果。

6、在儲存和(he)溫育時避免強光直接(jie)照射(she)。

7、平衡至室溫后再打開密封袋(dai)以(yi)防水滴凝聚在冷板條(tiao)上。

8、任何(he)反(fan)應試劑(ji)(ji)(ji)不能(neng)接觸(chu)漂白(bai)(bai)(bai)溶劑(ji)(ji)(ji)或漂白(bai)(bai)(bai)溶劑(ji)(ji)(ji)所散發(fa)的(de)強烈氣體。任何(he)漂白(bai)(bai)(bai)成分都會破壞試劑(ji)(ji)(ji)盒中反(fan)應試劑(ji)(ji)(ji)的(de)生(sheng)物活(huo)性。

9、不能使用過(guo)期產品。

10、如果可能傳播疾(ji)病，所(suo)有的(de)樣品都應管理(li)好(hao)，按(an)照(zhao)規定(ding)的(de)程序(xu)處理(li)樣品和(he)檢(jian)測裝(zhuang)置。

試劑準備

試(shi)劑盒從冷藏(zang)環境中取出應在室溫平衡后方可使(shi)用。

20×洗滌緩沖液的稀釋(shi)：蒸餾水按1：20稀釋(shi)，即(ji)1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操(cao)作步驟

1.從室溫平衡20min后(hou)的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用(yong)自封袋密(mi)封放回(hui)4℃。

2. 設置(zhi)標準(zhun)品(pin)(pin)孔(kong)和樣(yang)本(ben)孔(kong)，標準(zhun)品(pin)(pin)孔(kong)各加不(bu)同濃度的標準(zhun)品(pin)(pin)50μL；

3.樣(yang)本孔中(zhong)加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4. 除(chu)空白孔(kong)外，標準(zhun)品孔(kong)和(he)樣本孔(kong)中每孔(kong)加入辣根(gen)過(guo)氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜(mo)封住反應(ying)孔(kong)，37℃水(shui)浴鍋或(huo)恒溫箱溫育(yu)60min。

5. 棄去液體(ti)，吸(xi)水紙上拍干，每孔(kong)加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗(xi)滌(di)液，吸(xi)水紙(zhi)上(shang)拍干，如此重復洗(xi)板5次（也(ye)可用洗(xi)板機洗(xi)板）。

6.每孔加入(ru)底(di)物(wu)A、B各50μL，37℃避光孵(fu)育(yu)15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nei)，在450nm波長處測定各(ge)孔的OD值。

實驗結果計算(suan)

以所測標(biao)準品的OD值(zhi)為(wei)橫坐標，標準品的濃度(du)值為縱坐標(biao)，在坐標(biao)紙上或(huo)用相關軟件(jian)繪(hui)制(zhi)標準曲線，并得到直(zhi)線回歸方程，將樣(yang)品的OD值代入方程(cheng)，計(ji)算出(chu)樣(yang)品的濃度。

試(shi)劑盒性能(neng)

1、檢測范圍(wei)：0.25 mmol/L – 8 mmol/L。

2、靈敏度：低(di)檢(jian)測(ce)濃度小(xiao)于0.1 mmol/L。

3、特(te)異性：不與其它可溶(rong)性結構類(lei)似物交叉反應。

4、重復性：板內變異系數小(xiao)于(yu)10% ，板(ban)間變異系(xi)數(shu)小于15% 。