人組織因子途徑抑制物2（TFPI-2）ELISA試劑盒(he)免費代(dai)測

人組織因子(zi)途徑(jing)抑制物2（TFPI-2）ELISA試劑(ji)盒實驗(yan)原理

人組織因(yin)子途徑抑制物(wu)2（TFPI-2）試劑盒采用雙(shuang)抗(kang)體(ti)一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往(wang)預先(xian)包被人組織(zhi)因子(zi)途(tu)徑抑(yi)制物(wu)2（TFPI-2）捕獲(huo)抗(kang)體(ti)(ti)的包(bao)被(bei)微孔(kong)中，依次加入標(biao)(biao)本、標(biao)(biao)準品、HRP標(biao)(biao)記的檢測(ce)抗(kang)體(ti)(ti)，經過溫育并*洗滌(di)。用(yong)底物TMB顯色(se)，TMB在(zai)過氧化(hua)(hua)物酶的催化(hua)(hua)下(xia)轉化(hua)(hua)成藍色(se)，并在(zai)酸的作(zuo)用(yong)下(xia)轉化(hua)(hua)成終的黃色(se)。顏色(se)的深淺和樣品中的人組織(zhi)因子(zi)途徑抑制物(wu)2（TFPI-2）呈(cheng)正相關(guan)。用(yong)酶標儀在(zai)450nm 波長下測(ce)定吸光(guang)度（OD 值），計算樣品濃(nong)度。

樣本處理及要求

1.  血清(qing)：將收(shou)集于血(xue)清分離管(guan)的全(quan)血(xue)標本在室(shi)溫(wen)放置2小時(shi)或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可(ke)，或將上清置于-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反復凍融。
2.  血漿(jiang)：用EDTA或(huo)肝素作為抗(kang)凝劑采集標本(ben)，并(bing)將標本(ben)在采集后的30分鐘內(nei)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或(huo)將上清置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復(fu)凍(dong)融。
3.  組(zu)織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)(zu)織(zhi)，去除(chu)殘(can)留血液（勻(yun)漿中(zhong)裂解的紅(hong)細(xi)(xi)胞(bao)會影響測量結(jie)果），稱重后(hou)將(jiang)組(zu)(zu)織(zhi)剪碎。將(jiang)剪碎的組(zu)(zu)織(zhi)與對(dui)應體(ti)積的PBS（一(yi)般按1:9的重量體(ti)積比，比如(ru)1g的組(zu)(zu)織(zhi)樣品(pin)對(dui)應9mL的PBS，具體(ti)體(ti)積可(ke)根據實驗需(xu)要適當調(diao)整，并(bing)做好記(ji)錄。推薦(jian)在(zai)PBS中(zhong)加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻(yun)漿器中(zhong)，于冰上充分(fen)研磨。為了進一(yi)步(bu)裂解組(zu)(zu)織(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)，可(ke)以對(dui)勻(yun)漿液進行超(chao)聲破碎，或反復凍融。后(hou)將(jiang)勻(yun)漿液于5000×g離心5~10分(fen)鐘，取上清檢測。

4.  細(xi)胞培(pei)養物(wu)上(shang)清或其它生(sheng)物(wu)標本：請(qing)1000×g離(li)心20分鐘，取上(shang)清(qing)即可檢測，或將上(shang)清(qing)置于-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免反復凍融。

注(zhu)：標本(ben)溶血會影響后檢測結果，因此(ci)溶血標本(ben)不宜進行此(ci)項檢測。

需要(yao)而未提供(gong)的試劑盒器材

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸(zheng)餾(liu)水或(huo)去離子(zi)水

人組織因子途徑抑制物(wu)2（TFPI-2）ELISA試劑盒組(zu)成

備(bei)注：

1.  標準品濃度依(yi)次為：48、24、12、6、3、1.5 pg/mL

2.  經過大量正常標本檢驗(yan)，標本的正常濃度值(zhi)均(jun)在試劑盒提(ti)供的檢測范圍內，實驗(yan)過程中直(zhi)接取(qu)50μL樣本(ben)上樣即可。當有部分(fen)樣本(ben)值超(chao)過大標準品濃(nong)度時，可用樣本(ben)稀(xi)釋液將標本(ben)進行適當稀(xi)釋后再進行實驗。

注意(yi)事項

1、嚴格按照規定(ding)的時間(jian)和溫度進行溫育以保證(zheng)準確結果。所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)都必須在使用前達到室(shi)溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試(shi)劑(ji)。

2、洗板(ban)不(bu)正確(que)可以導致(zhi)不(bu)準確(que)的結(jie)果。在加入(ru)底(di)物前確(que)保盡(jin)量(liang)吸干孔內液體。溫(wen)育過程中不(bu)要讓微孔干燥掉。

3、消(xiao)除板底殘留(liu)的液體和手指印，否則(ze)影響(xiang)OD值。

4、底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變(bian)藍(lan)的底物液不能使用。

5、避免試劑和標本的交(jiao)叉污(wu)染以(yi)免造成錯誤結果(guo)。

6、在儲(chu)存和溫育時避免強(qiang)光直(zhi)接照(zhao)射。

7、平(ping)衡至室溫后再打開密封袋以防水滴(di)凝聚(ju)在冷(leng)板條上。

8、任(ren)何反應試(shi)劑(ji)不能(neng)接觸漂(piao)白(bai)溶劑(ji)或漂(piao)白(bai)溶劑(ji)所散(san)發的強烈氣體(ti)。任(ren)何漂(piao)白(bai)成分都會破壞試(shi)劑(ji)盒中反應試(shi)劑(ji)的生物(wu)活性。

9、不能(neng)使用(yong)過(guo)期產品。

10、如果可(ke)能傳播疾(ji)病，所有的樣品(pin)都應管理(li)好(hao)，按照(zhao)規定(ding)的程序處理(li)樣品(pin)和檢測裝置。

試(shi)劑準備

試劑盒從冷藏環境中取出(chu)應在室(shi)溫平衡后方可使用。

20×洗(xi)滌緩沖(chong)液的稀釋(shi)：蒸(zheng)(zheng)餾水(shui)按1：20稀釋(shi)，即1份20×洗(xi)滌緩沖(chong)液加(jia)19份蒸(zheng)(zheng)餾水(shui)。

操(cao)作步驟

1.從室溫平(ping)衡20min后的鋁箔袋(dai)中取(qu)出(chu)所需板條，剩(sheng)余(yu)板條用自封(feng)袋(dai)密封(feng)放回4℃。

2. 設(she)置標準品(pin)孔和樣本孔，標準品(pin)孔各加不同濃度(du)的標準品(pin)50μL；

3.樣本(ben)孔中加入待測樣本(ben)50μL；空白孔不加。

4. 除(chu)空(kong)白孔(kong)(kong)外，標(biao)準品(pin)孔(kong)(kong)和樣本孔(kong)(kong)中每孔(kong)(kong)加入辣(la)根過氧(yang)化物酶（HRP）標(biao)記的檢測抗體100μL，用封(feng)板膜(mo)封(feng)住反應孔(kong)(kong)，37℃水浴(yu)鍋或恒(heng)溫(wen)箱溫(wen)育(yu)60min。

5. 棄(qi)去液(ye)體，吸(xi)水紙(zhi)上拍干，每(mei)孔(kong)加滿洗(xi)滌(di)液(ye)（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板(ban)5次（也可用洗板(ban)機洗板(ban)）。

6.每孔加(jia)入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處(chu)測定各孔的OD值(zhi)。

實驗(yan)結果(guo)計(ji)算

以所測標準品的OD值(zhi)為橫(heng)坐標，標準品的濃度值為(wei)縱(zong)坐(zuo)標，在(zai)坐(zuo)標紙上或用相關(guan)軟件(jian)繪制(zhi)標準曲線，并得(de)到(dao)直線回歸方程，將樣品的OD值(zhi)代入方程，計算出樣品的(de)濃(nong)度(du)。

試劑(ji)盒(he)性(xing)能(neng)

1、檢測范圍：1.5 pg/mL – 48 pg/mL。

2、靈敏度(du)(du)：低檢測濃(nong)度(du)(du)小于0.1 pg/mL。

3、特(te)異性：不與其它可(ke)溶性結(jie)構(gou)類似物(wu)交叉反(fan)應。

4、重復性：板(ban)內變異(yi)系數小于10% ，板間變異系數小于(yu)15% 。