小鼠水(shui)通道(dao)蛋白4（AQP-4）ELISA試劑盒課題研究

小鼠水通道蛋白4（AQP-4）ELISA試劑盒實驗原理

小鼠(shu)水通道(dao)蛋白4（AQP-4）試劑盒采用(yong)雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包(bao)被小鼠水通(tong)道蛋白4（AQP-4）捕獲抗體的(de)包被(bei)微孔中，依次加入標(biao)本、標(biao)準品、HRP標(biao)記的(de)檢測抗體，經(jing)過溫(wen)育并(bing)*洗滌。用底物TMB顯(xian)色，TMB在過氧化物酶的(de)催(cui)化下(xia)轉化成藍色，并(bing)在酸的(de)作用下(xia)轉化成終的(de)黃色。顏色的(de)深淺(qian)和樣品中的(de)小鼠水通道蛋白4（AQP-4）呈(cheng)正相(xiang)關(guan)。用(yong)酶標儀在450nm 波長下(xia)測定吸(xi)光度(du)（OD 值），計算樣(yang)品濃度(du)。

樣本處理及(ji)要求

1.  血清：將收集于血清分離管(guan)的(de)全(quan)血標(biao)本在室溫放置2小時或4℃過(guo)夜，然后1000×g離心(xin)20 分鐘，取上清即可，或(huo)將(jiang)上清置于(yu)-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免反復凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝(ning)劑采集(ji)標本，并將標本在采集(ji)后的(de)30分鐘內于(yu)2-8℃ 1000×g離心15分鐘(zhong)，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保(bao)存，但(dan)應(ying)避免反(fan)復凍融。
3.  組(zu)織勻(yun)漿：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織(zhi)(zhi)，去除殘留血液(ye)（勻(yun)(yun)漿(jiang)中裂(lie)解(jie)的(de)紅細胞會(hui)影響(xiang)測(ce)量結果），稱重(zhong)后將組織(zhi)(zhi)剪(jian)碎。將剪(jian)碎的(de)組織(zhi)(zhi)與(yu)對應體積的(de)PBS（一(yi)般按1:9的(de)重(zhong)量體積比(bi)，比(bi)如1g的(de)組織(zhi)(zhi)樣(yang)品對應9mL的(de)PBS，具體體積可(ke)根據實(shi)驗(yan)需要適當調(diao)整，并做好(hao)記錄(lu)。推(tui)薦在PBS中加入蛋白酶抑制(zhi)劑）加入玻(bo)璃勻(yun)(yun)漿(jiang)器中，于冰(bing)上(shang)(shang)充分研磨。為了(le)進(jin)一(yi)步裂(lie)解(jie)組織(zhi)(zhi)細胞，可(ke)以對勻(yun)(yun)漿(jiang)液(ye)進(jin)行超聲破碎，或反復(fu)凍融。后將勻(yun)(yun)漿(jiang)液(ye)于5000×g離心5~10分鐘，取(qu)上(shang)(shang)清檢測(ce)。

4.  細胞(bao)培養(yang)物上清或其它生(sheng)物標本：請1000×g離心20分(fen)鐘(zhong)，取上清(qing)(qing)即可檢測，或將(jiang)上清(qing)(qing)置于-20℃或-80℃保(bao)存(cun)，但應避免反復(fu)凍融(rong)。

注：標本溶血會影(ying)響后檢(jian)測(ce)結(jie)果，因(yin)此溶血標本不宜進行此項檢(jian)測(ce)。

需要而未提供的試劑(ji)盒器材(cai)

1.酶標儀(yi)（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水(shui)(shui)或(huo)去(qu)離(li)子水(shui)(shui)

小鼠水(shui)通道蛋白(bai)4（AQP-4）ELISA試劑盒組(zu)成

備注：

1.  標準(zhun)品濃度依次為：800、400、200、100、50、25 pg/mL

2.  經過大量正(zheng)常標(biao)本檢驗(yan)，標(biao)本的(de)(de)正(zheng)常濃度值(zhi)均在試劑盒提供的(de)(de)檢測范圍(wei)內，實驗(yan)過程中直接(jie)取50μL樣本上樣即可。當有部(bu)分樣本值超過大(da)標準品濃度時(shi)，可用樣本稀(xi)釋液將(jiang)標本進(jin)(jin)行適當稀(xi)釋后(hou)再進(jin)(jin)行實驗(yan)。

注意(yi)事項

1、嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以(yi)保(bao)證準確結(jie)果。所有試劑都必須(xu)在(zai)使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保(bao)存試劑。

2、洗板不(bu)(bu)正(zheng)確可(ke)以(yi)導致(zhi)不(bu)(bu)準確的結果。在加入底(di)物前(qian)確保盡(jin)量吸(xi)干孔(kong)內液體。溫育(yu)過程中不(bu)(bu)要讓微孔(kong)干燥掉(diao)。

3、消除板底(di)殘留的液體(ti)和手指印，否(fou)則影響OD值。

4、底(di)物顯色液(ye)應呈(cheng)無色或很淺(qian)的顏色，已經變藍的底(di)物液(ye)不(bu)能使(shi)用。

5、避(bi)免試(shi)劑和標本的(de)交叉(cha)污染以免造成錯誤結果。

6、在儲存和溫育時避免強光直(zhi)接(jie)照(zhao)射。

7、平衡至室溫(wen)后(hou)再打開密封(feng)袋(dai)以防水滴凝聚(ju)在(zai)冷板(ban)條(tiao)上。

8、任(ren)何(he)反(fan)應(ying)試(shi)(shi)(shi)劑不能(neng)接(jie)觸漂白(bai)溶劑或漂白(bai)溶劑所散發的強(qiang)烈氣體。任(ren)何(he)漂白(bai)成分都會破(po)壞試(shi)(shi)(shi)劑盒中反(fan)應(ying)試(shi)(shi)(shi)劑的生物(wu)活性。

9、不能使用過期產品。

10、如果可能傳播疾(ji)病，所(suo)有(you)的(de)樣品(pin)都應管理(li)好(hao)，按照規定的(de)程序處理(li)樣品(pin)和檢(jian)測裝置(zhi)。

試劑準備

試劑盒從冷藏環境(jing)中取出應在室溫平衡(heng)后方可使用。

20×洗滌緩(huan)沖(chong)液的稀(xi)釋(shi)：蒸餾水按1：20稀(xi)釋(shi)，即1份20×洗滌緩(huan)沖(chong)液加19份蒸餾水。

操(cao)作(zuo)步驟

1.從室(shi)溫平衡(heng)20min后的鋁箔袋(dai)中取出所需板條，剩余板條用自封袋(dai)密封放(fang)回4℃。

2. 設(she)置標準品孔和(he)樣(yang)本孔，標準品孔各加不同濃(nong)度(du)的標準品50μL；

3.樣(yang)本孔(kong)中加入待(dai)測樣本(ben)50μL；空白孔不加(jia)。

4. 除空白孔(kong)(kong)外，標(biao)(biao)準品孔(kong)(kong)和樣本孔(kong)(kong)中每孔(kong)(kong)加入辣(la)根過氧化物酶（HRP）標(biao)(biao)記(ji)的檢(jian)測抗體100μL，用封板膜(mo)封住反應孔(kong)(kong)，37℃水浴鍋或(huo)恒溫箱溫育(yu)60min。

5. 棄去液體(ti)，吸水(shui)紙上拍干(gan)，每(mei)孔加(jia)滿洗(xi)滌液（350μL），靜置1min，甩(shuai)去洗(xi)滌(di)液，吸水紙上(shang)拍干，如此重復(fu)洗(xi)板5次（也可用洗(xi)板機洗(xi)板）。

6.每孔加入底(di)物A、B各50μL，37℃避光孵育(yu)15min。

7.每孔(kong)加入(ru)終止液50μL，15min內，在450nm波長(chang)處測定各孔(kong)的OD值。

實驗結果計算

以所測標準(zhun)品的(de)OD值為橫(heng)坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關(guan)軟(ruan)件繪(hui)制標準曲線，并(bing)得(de)到直線回(hui)歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出(chu)樣品的濃度。

試(shi)劑盒性能

1、檢(jian)測范(fan)圍：25 pg/mL – 800 pg/mL。

2、靈敏度(du)：低(di)檢測濃(nong)度(du)小于1.0 pg/mL。

3、特異性：不與其它(ta)可溶(rong)性結構類似物交叉反應。

4、重(zhong)復性(xing)：板內變異(yi)系數小于(yu)10% ，板間變(bian)異系(xi)數小(xiao)于15% 。