豬一氧化氮（NO）ELISA試(shi)劑盒課題(ti)研究

豬一氧化氮（NO）ELISA試劑(ji)盒實驗(yan)原理

豬一(yi)氧化氮(dan)（NO）試劑盒采用雙抗體(ti)一(yi)步夾心法酶(mei)聯免疫(yi)吸(xi)附試驗（ELISA）。往預先包(bao)被豬一氧化氮（NO）捕(bu)獲抗體(ti)的(de)包(bao)被(bei)微孔中，依(yi)次加入(ru)標(biao)本(ben)、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記的(de)檢測抗體(ti)，經過溫(wen)育并*洗滌。用(yong)底物(wu)TMB顯色，TMB在過氧化(hua)(hua)物(wu)酶的(de)催(cui)化(hua)(hua)下轉(zhuan)化(hua)(hua)成(cheng)藍色，并在酸的(de)作用(yong)下轉(zhuan)化(hua)(hua)成(cheng)終的(de)黃色。顏色的(de)深(shen)淺和(he)樣品(pin)中的(de)豬(zhu)一氧化氮(dan)（NO）呈正相關。用(yong)酶(mei)標儀在450nm 波長下測定(ding)吸光度(du)(du)（OD 值(zhi)），計(ji)算(suan)樣品濃度(du)(du)。

樣本處理及要求

1.  血清：將收(shou)集(ji)于血(xue)清(qing)分(fen)離(li)管的全(quan)血(xue)標(biao)本在室溫放置(zhi)2小時或4℃過(guo)夜，然后1000×g離心(xin)20 分鐘，取上(shang)清即可，或將上(shang)清置于(yu)-20℃或-80℃保存，但應避免(mian)反復凍融。
2.  血漿：用(yong)EDTA或肝素作為抗凝(ning)劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢(jian)測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.  組織勻漿：用預冷的(de)(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)(zu)織(zhi)，去除殘留血液（勻漿(jiang)(jiang)中(zhong)(zhong)裂(lie)解(jie)的(de)(de)(de)紅(hong)細胞會影(ying)響測量結果），稱重后將(jiang)組(zu)(zu)織(zhi)剪碎(sui)。將(jiang)剪碎(sui)的(de)(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)與對應體積的(de)(de)(de)PBS（一(yi)般按(an)1:9的(de)(de)(de)重量體積比，比如1g的(de)(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)樣品(pin)對應9mL的(de)(de)(de)PBS，具體體積可根據實驗(yan)需要(yao)適當調整，并(bing)做好記錄。推薦在PBS中(zhong)(zhong)加(jia)入蛋白酶抑制劑）加(jia)入玻璃勻漿(jiang)(jiang)器中(zhong)(zhong)，于冰上充(chong)分研磨。為了(le)進一(yi)步裂(lie)解(jie)組(zu)(zu)織(zhi)細胞，可以對勻漿(jiang)(jiang)液進行超聲破碎(sui)，或反復(fu)凍融。后將(jiang)勻漿(jiang)(jiang)液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.  細胞培(pei)養(yang)物上清或(huo)其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取(qu)上清即可檢測(ce)，或將上清置于(yu)-20℃或-80℃保(bao)存，但應避免反復凍融(rong)。

注：標本溶血(xue)會(hui)影響后檢測(ce)結果，因(yin)此溶血(xue)標本不宜進(jin)行此項檢測(ce)。

需要(yao)而未(wei)提供的試(shi)劑盒(he)器材

1.酶標儀(yi)（450nm）

2.高(gao)精(jing)度加樣(yang)器及槍(qiang)頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾(liu)水或去離(li)子(zi)水

豬(zhu)一(yi)氧化氮（NO）ELISA試劑盒組成(cheng)

備注：

1.  標準品濃度依次為(wei)：200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L

2.  經過(guo)大量正(zheng)常標(biao)本檢驗，標(biao)本的正(zheng)常濃度值均(jun)在試(shi)劑盒提供(gong)的檢測(ce)范圍(wei)內(nei)，實驗過(guo)程中直接取50μL樣(yang)(yang)本(ben)上樣(yang)(yang)即可(ke)。當有部(bu)分樣(yang)(yang)本(ben)值(zhi)超(chao)過大標準(zhun)品濃度時，可(ke)用樣(yang)(yang)本(ben)稀(xi)釋液將標本(ben)進(jin)行適當稀(xi)釋后再進(jin)行實驗(yan)。

注(zhu)意(yi)事項

1、嚴(yan)格(ge)按照規(gui)定的時間(jian)和溫度進行溫育以保證準確結(jie)果(guo)。所有試劑(ji)都必須在使(shi)用前達(da)到(dao)室溫20-25℃。使(shi)用后立即(ji)冷藏保存試劑(ji)。

2、洗板不(bu)(bu)正(zheng)確可以導致不(bu)(bu)準確的(de)結果。在加(jia)入底物前確保盡量吸干孔內液體(ti)。溫育過程中(zhong)不(bu)(bu)要讓微孔干燥(zao)掉。

3、消除板(ban)底殘留的(de)液體和手指(zhi)印，否(fou)則影(ying)響OD值(zhi)。

4、底(di)物顯色(se)液應呈無色(se)或很淺(qian)的(de)(de)顏(yan)色(se)，已經變藍的(de)(de)底(di)物液不能使用。

5、避免試劑(ji)和標本的(de)交叉污(wu)染以免造成錯誤結果(guo)。

6、在儲存和(he)溫育時避免強光直接照射。

7、平(ping)衡(heng)至室溫(wen)后再打開密(mi)封袋以(yi)防(fang)水滴(di)凝聚在冷板(ban)條(tiao)上(shang)。

8、任(ren)何反應試劑不能接觸漂(piao)白(bai)溶劑或漂(piao)白(bai)溶劑所散(san)發的強(qiang)烈氣體。任(ren)何漂(piao)白(bai)成(cheng)分都會破(po)壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9、不能使用過期產品。

10、如果可(ke)能傳(chuan)播疾(ji)病，所有的(de)(de)樣(yang)(yang)品(pin)都應管理(li)好，按(an)照規定的(de)(de)程序處理(li)樣(yang)(yang)品(pin)和檢測裝(zhuang)置。

試劑準備

試(shi)劑盒從冷藏環境中(zhong)取出應在室溫平衡后方可(ke)使用。

20×洗(xi)滌(di)(di)緩沖(chong)液(ye)的稀釋：蒸餾水(shui)按1：20稀釋，即1份(fen)20×洗(xi)滌(di)(di)緩沖(chong)液(ye)加19份(fen)蒸餾水(shui)。

操(cao)作步驟

1.從室溫平衡20min后的鋁(lv)箔袋(dai)中取出所需板(ban)條(tiao)，剩余板(ban)條(tiao)用自封(feng)袋(dai)密封(feng)放回4℃。

2. 設置標(biao)(biao)準品孔和樣本孔，標(biao)(biao)準品孔各加(jia)不同濃(nong)度的標(biao)(biao)準品50μL；

3.樣本孔中加(jia)入(ru)待測樣本50μL；空白孔(kong)不加(jia)。

4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加(jia)入(ru)辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢(jian)測抗體100μL，用封板膜封住反(fan)應孔，37℃水浴鍋或(huo)恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸(xi)水紙(zhi)上拍干，每(mei)孔(kong)加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩(shuai)去洗滌液，吸水紙上拍干，如(ru)此重復(fu)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物(wu)A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔(kong)加入終止液50μL，15min內(nei)，在450nm波長處測(ce)定各孔(kong)的OD值。

實驗結果計算

以所測(ce)標準品的(de)OD值為橫坐(zuo)標，標準品的濃度值為(wei)縱坐標(biao)，在坐標(biao)紙上或用相關軟件繪制(zhi)標(biao)準曲線，并得(de)到直線回歸方程，將樣(yang)品(pin)的OD值(zhi)代(dai)入方(fang)程，計算出樣(yang)品(pin)的濃(nong)度(du)。

試(shi)劑盒(he)性能(neng)

1、檢測范圍(wei)：6.25 μmol/L – 200 μmol/L。

2、靈敏度(du)：低(di)檢(jian)測濃度(du)小于1.0 μmol/L。

3、特異(yi)性(xing)：不與其(qi)它可溶性(xing)結(jie)構類似物交叉反(fan)應。

4、重(zhong)復性：板內變(bian)異系數(shu)小于10% ，板(ban)間變(bian)異系數(shu)小于15% 。