大鼠磷酸化細胞外信號調節激酶（pERK）ELISA試劑(ji)盒品牌現貨

大鼠磷酸(suan)化細(xi)胞外信號(hao)調節激酶（pERK）ELISA試(shi)劑盒(he)實驗原理

大鼠磷酸化細胞外信號調節(jie)激酶(mei)（pERK）試劑盒采用雙(shuang)抗(kang)體一步夾心法(fa)酶聯免疫吸(xi)附試驗（ELISA）。往預先包被大鼠磷酸化細胞外信號調節激酶（pERK）捕獲抗體的(de)(de)包被微孔中，依次加入標本(ben)、標準品(pin)(pin)、HRP標記的(de)(de)檢測抗體，經過(guo)溫(wen)育并*洗滌。用(yong)底物(wu)TMB顯色，TMB在過(guo)氧化(hua)(hua)物(wu)酶(mei)的(de)(de)催化(hua)(hua)下轉(zhuan)(zhuan)化(hua)(hua)成藍色，并在酸的(de)(de)作(zuo)用(yong)下轉(zhuan)(zhuan)化(hua)(hua)成終的(de)(de)黃色。顏色的(de)(de)深淺和樣(yang)品(pin)(pin)中的(de)(de)大鼠磷酸化細(xi)胞外信(xin)號調節(jie)激酶（pERK）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測(ce)定吸光度（OD 值(zhi)），計算樣品濃度。

樣(yang)本(ben)處理及(ji)要(yao)求(qiu)

1.  血清(qing)：將(jiang)收集于血清分離管(guan)的全血標本在室溫放置2小時(shi)或4℃過(guo)夜，然(ran)后1000×g離心20 分鐘，取上清即(ji)可，或(huo)將上清置于-20℃或-80℃保存，但(dan)應避免反復凍(dong)融。
2.  血漿：用(yong)EDTA或肝素(su)作為(wei)抗凝劑(ji)采(cai)集標本，并將標本在采(cai)集后的(de)30分鐘內(nei)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上(shang)清即可檢測，或(huo)將上(shang)清置于(yu)-20℃或-80℃保存，但應(ying)避免反復凍融(rong)。
3.  組織勻漿：用(yong)預(yu)冷的(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組(zu)織(zhi)，去除殘(can)留血液(ye)(ye)（勻漿(jiang)(jiang)(jiang)中裂(lie)解的(de)(de)紅細胞會影響測量結果），稱重后(hou)將(jiang)組(zu)織(zhi)剪(jian)碎。將(jiang)剪(jian)碎的(de)(de)組(zu)織(zhi)與(yu)對應體(ti)積的(de)(de)PBS（一(yi)般按1:9的(de)(de)重量體(ti)積比，比如1g的(de)(de)組(zu)織(zhi)樣品對應9mL的(de)(de)PBS，具(ju)體(ti)體(ti)積可根據實驗需(xu)要(yao)適當(dang)調整，并做(zuo)好記錄。推薦(jian)在(zai)PBS中加(jia)入(ru)蛋白酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)）加(jia)入(ru)玻璃勻漿(jiang)(jiang)(jiang)器(qi)中，于(yu)冰上充(chong)分研磨。為了進(jin)一(yi)步裂(lie)解組(zu)織(zhi)細胞，可以對勻漿(jiang)(jiang)(jiang)液(ye)(ye)進(jin)行超聲(sheng)破碎，或(huo)反復凍融。后(hou)將(jiang)勻漿(jiang)(jiang)(jiang)液(ye)(ye)于(yu)5000×g離心5~10分鐘，取(qu)上清檢測。

4.  細胞培養(yang)物上清(qing)或其它生物標(biao)本：請1000×g離心20分鐘，取(qu)上清(qing)即可檢測，或將上清(qing)置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但應避免反(fan)復凍融。

注：標本(ben)(ben)溶血(xue)會影響后檢(jian)測(ce)結果，因此(ci)溶血(xue)標本(ben)(ben)不宜進行此(ci)項檢(jian)測(ce)。

需(xu)要而未提供的試劑盒(he)器材(cai)

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加(jia)樣器(qi)及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水(shui)或去離子(zi)水(shui)

大鼠磷酸(suan)化細胞(bao)外信號調(diao)節激酶（pERK）ELISA試劑盒組成(cheng)

備(bei)注：

1.  標準品濃度依次為：160、80、40、20、10、5 U/mL

2.  經(jing)過大(da)量正(zheng)常標(biao)本檢驗，標(biao)本的(de)正(zheng)常濃度值均在試劑盒提供的(de)檢測范(fan)圍內，實驗過程中(zhong)直接取50μL樣本(ben)上樣即可(ke)。當有部分樣本(ben)值超過(guo)大(da)標準品濃度時(shi)，可(ke)用樣本(ben)稀釋(shi)(shi)液將標本(ben)進(jin)行適當稀釋(shi)(shi)后再(zai)進(jin)行實驗。

注意事項

1、嚴格(ge)按照規定的時間(jian)和溫(wen)度進行(xing)溫(wen)育(yu)以保證準(zhun)確結果。所有試劑都必須(xu)在使用前達到室溫(wen)20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2、洗板(ban)不(bu)正確(que)(que)可以(yi)導致不(bu)準確(que)(que)的(de)結果(guo)。在(zai)加入(ru)底(di)物前確(que)(que)保盡量(liang)吸干孔(kong)內液體。溫育過程中(zhong)不(bu)要(yao)讓(rang)微孔(kong)干燥掉。

3、消除(chu)板底殘留的液體(ti)和手(shou)指印，否則影(ying)響OD值。

4、底物顯色(se)(se)液應(ying)呈無(wu)色(se)(se)或很淺的(de)顏色(se)(se)，已經變(bian)藍的(de)底物液不能使(shi)用。

5、避免(mian)試劑(ji)和標(biao)本的交(jiao)叉污染以免(mian)造成錯誤(wu)結(jie)果。

6、在儲存(cun)和(he)溫育時避免強光直(zhi)接照射。

7、平衡至室溫后再打開(kai)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上(shang)。

8、任何反應試(shi)劑(ji)不(bu)能接觸(chu)漂白溶劑(ji)或漂白溶劑(ji)所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試(shi)劑(ji)盒中反應試(shi)劑(ji)的生(sheng)物活性。

9、不能使(shi)用過期(qi)產品。

10、如果(guo)可能(neng)傳播疾(ji)病，所有的(de)樣品都應管理(li)好，按照規定的(de)程序處理(li)樣品和檢測裝置。

試(shi)劑準備

試劑(ji)盒從(cong)冷藏環境中取(qu)出(chu)應在(zai)室溫平衡后方(fang)可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋(shi)：蒸(zheng)餾水按1：20稀釋(shi)，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸(zheng)餾水。

操作步驟

1.從室(shi)溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需(xu)板條，剩(sheng)余(yu)板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設置(zhi)標(biao)(biao)準(zhun)品孔(kong)和樣本孔(kong)，標(biao)(biao)準(zhun)品孔(kong)各加不同濃度的標(biao)(biao)準(zhun)品50μL；

3.樣本孔中加(jia)入待測樣本50μL；空白孔不(bu)加(jia)。

4. 除空白孔(kong)(kong)(kong)外，標準(zhun)品孔(kong)(kong)(kong)和樣(yang)本孔(kong)(kong)(kong)中每孔(kong)(kong)(kong)加入辣根過氧化(hua)物酶（HRP）標記(ji)的檢測抗體(ti)100μL，用(yong)封板膜封住反應孔(kong)(kong)(kong)，37℃水(shui)浴(yu)鍋或恒(heng)溫(wen)箱(xiang)溫(wen)育(yu)60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍(pai)干(gan)，每孔(kong)加滿(man)洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗(xi)滌液(ye)，吸(xi)水紙上(shang)拍干，如此重復洗(xi)板5次（也可用(yong)洗(xi)板機洗(xi)板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止(zhi)液50μL，15min內(nei)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果(guo)計算(suan)

以所測標準品(pin)的OD值為(wei)橫坐(zuo)標，標準品的濃度值為(wei)縱坐(zuo)標(biao)，在坐(zuo)標(biao)紙上(shang)或用相關(guan)軟件繪制標(biao)準曲線，并得到直(zhi)線回歸方程，將(jiang)樣(yang)品(pin)的OD值代入方程，計算出(chu)樣(yang)品(pin)的濃度。

試(shi)劑盒性(xing)能

1、檢測范圍(wei)：5 U/mL – 160 U/mL。

2、靈(ling)敏度：低檢測濃度小于1.0 U/mL。

3、特異(yi)性(xing)：不與(yu)其它(ta)可(ke)溶性(xing)結構類似物交叉反應。

4、重(zhong)復性：板內變(bian)異系數小(xiao)于10% ，板間(jian)變異系數(shu)小于15% 。