小鼠白細胞介素8（IL-8）ELISA試劑盒(he)操作(zuo)步(bu)驟

小鼠(shu)白細(xi)胞介素8（IL-8）ELISA試劑盒(he)實驗原(yuan)理

小鼠白細胞(bao)介(jie)素8（IL-8）試劑盒采用雙抗體一步(bu)夾(jia)心法(fa)酶聯免疫吸附(fu)試驗（ELISA）。往預先包被(bei)小鼠白細胞介素8（IL-8）捕(bu)獲抗(kang)體(ti)的(de)(de)包被微孔中，依次加(jia)入標本、標準(zhun)品、HRP標記(ji)的(de)(de)檢測抗(kang)體(ti)，經過(guo)(guo)溫育(yu)并*洗滌。用(yong)底物TMB顯色(se)，TMB在過(guo)(guo)氧化(hua)物酶的(de)(de)催化(hua)下(xia)(xia)轉化(hua)成藍色(se)，并在酸的(de)(de)作用(yong)下(xia)(xia)轉化(hua)成終的(de)(de)黃色(se)。顏(yan)色(se)的(de)(de)深淺和樣品中的(de)(de)小鼠白細胞(bao)介素8（IL-8）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光(guang)度(du)（OD 值），計算樣品濃度(du)。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于(yu)血清分離(li)管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心(xin)20 分鐘，取(qu)上清(qing)即(ji)可，或將上清(qing)置(zhi)于-20℃或-80℃保存，但應(ying)避免反復凍融。
2.  血(xue)漿：用EDTA或肝素(su)作為抗凝劑采(cai)(cai)集(ji)標(biao)本(ben)，并將標(biao)本(ben)在(zai)采(cai)(cai)集(ji)后的30分(fen)鐘內于2-8℃ 1000×g離(li)心(xin)15分(fen)鐘，取上清即可檢測，或將(jiang)上清置于(yu)-20℃或-80℃保存(cun)，但應避免(mian)反(fan)復(fu)凍融。
3.  組(zu)織勻漿：用(yong)預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組(zu)織，去(qu)除殘留(liu)血液(ye)（勻漿中裂(lie)解的(de)紅細(xi)胞(bao)會影響測量結果），稱重后將組(zu)織剪(jian)碎。將剪(jian)碎的(de)組(zu)織與對(dui)應(ying)體積的(de)PBS（一(yi)(yi)般按(an)1:9的(de)重量體積比，比如1g的(de)組(zu)織樣品對(dui)應(ying)9mL的(de)PBS，具體體積可根據實驗需要適當調(diao)整，并做(zuo)好記錄。推薦在PBS中加(jia)入(ru)蛋白酶抑制劑(ji)）加(jia)入(ru)玻(bo)璃(li)勻漿器中，于冰上(shang)充分研(yan)磨(mo)。為了進一(yi)(yi)步(bu)裂(lie)解組(zu)織細(xi)胞(bao)，可以對(dui)勻漿液(ye)進行超聲破(po)碎，或反復凍(dong)融。后將勻漿液(ye)于5000×g離心5~10分鐘，取上(shang)清檢(jian)測。

4.  細胞培養(yang)物上清或其它生物標(biao)本(ben)：請1000×g離心20分鐘(zhong)，取上清即可(ke)檢(jian)測，或(huo)將上清置(zhi)于-20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，但應避免反復凍(dong)融。

注(zhu)：標本溶(rong)血(xue)會影(ying)響后檢測(ce)結果，因此溶(rong)血(xue)標本不宜進行此項檢測(ce)。

需(xu)要而未提供(gong)的試劑盒(he)器材

1.酶標儀（450nm）

2.高精度(du)加樣器及槍(qiang)頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒(heng)溫(wen)箱

4.蒸餾水或去離子水

小(xiao)鼠白細胞介素8（IL-8）ELISA試劑(ji)盒組(zu)成

備注：

1.  標準(zhun)品濃(nong)度依次(ci)為(wei)：120、60、30、15、7.5、3.75 pg/mL

2.  經過大量(liang)正常標本檢(jian)(jian)驗(yan)，標本的正常濃(nong)度(du)值均在試劑盒提供的檢(jian)(jian)測范圍(wei)內(nei)，實驗(yan)過程中直接取50μL樣(yang)(yang)本上樣(yang)(yang)即可(ke)。當有部分樣(yang)(yang)本值超過大標準品濃度時，可(ke)用樣(yang)(yang)本稀(xi)釋(shi)液(ye)將標本進(jin)行(xing)適當稀(xi)釋(shi)后再進(jin)行(xing)實驗(yan)。

注(zhu)意事(shi)項

1、嚴格按照規定的(de)時間和溫(wen)度進行溫(wen)育(yu)以保證(zheng)準確結果。所有試劑(ji)都必須在使用前(qian)達到室溫(wen)20-25℃。使用后立(li)即冷藏(zang)保存試劑(ji)。

2、洗板不正(zheng)確(que)(que)可以(yi)導致(zhi)不準確(que)(que)的結(jie)果。在加入底物前確(que)(que)保盡量吸(xi)干孔內液體。溫(wen)育過程中不要讓微孔干燥(zao)掉。

3、消(xiao)除(chu)板底殘留的液體和手指印，否(fou)則影響(xiang)OD值(zhi)。

4、底(di)物顯色(se)液應呈無色(se)或很淺的顏色(se)，已經變(bian)藍的底(di)物液不(bu)能使用。

5、避(bi)免(mian)試劑和標本的交(jiao)叉污染(ran)以(yi)免(mian)造成錯誤結果。

6、在儲(chu)存和(he)溫(wen)育時(shi)避免強光直(zhi)接照射。

7、平衡(heng)至室溫后再(zai)打開密封(feng)袋以防水滴(di)凝(ning)聚(ju)在冷板條上(shang)。

8、任(ren)何(he)反(fan)應試劑不(bu)能接(jie)觸漂白(bai)溶(rong)劑或漂白(bai)溶(rong)劑所(suo)散發的強烈氣(qi)體。任(ren)何(he)漂白(bai)成分都會破壞試劑盒(he)中反(fan)應試劑的生物活性。

9、不能使用過期(qi)產(chan)品。

10、如果(guo)可能傳播疾病(bing)，所有的樣(yang)(yang)品都(dou)應管理好，按照規(gui)定的程序處理樣(yang)(yang)品和檢(jian)測裝(zhuang)置。

試劑(ji)準備

試劑盒從冷藏(zang)環境(jing)中取(qu)出(chu)應(ying)在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩(huan)沖液的稀釋(shi)：蒸餾水(shui)按1：20稀釋(shi)，即1份(fen)20×洗滌緩(huan)沖液加19份(fen)蒸餾水(shui)。

操作步驟

1.從室(shi)溫平衡20min后的鋁箔袋(dai)(dai)中(zhong)取(qu)出所需板條，剩(sheng)余板條用自封袋(dai)(dai)密封放回4℃。

2. 設置標準(zhun)(zhun)品(pin)孔和樣本(ben)孔，標準(zhun)(zhun)品(pin)孔各加(jia)不同濃度的標準(zhun)(zhun)品(pin)50μL；

3.樣本孔中(zhong)加入(ru)待測樣本50μL；空白(bai)孔不加。

4. 除空白孔外(wai)，標準品孔和樣(yang)本孔中每孔加(jia)入辣根過氧(yang)化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(ying)孔，37℃水(shui)浴(yu)鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去(qu)液(ye)體，吸水紙上(shang)拍干，每(mei)孔加(jia)滿洗滌液(ye)（350μL），靜置1min，甩(shuai)去洗(xi)滌液，吸水(shui)紙上拍干，如(ru)此重復洗(xi)板(ban)5次（也可用(yong)洗(xi)板(ban)機洗(xi)板(ban)）。

6.每孔加入底(di)物(wu)A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔(kong)(kong)加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔(kong)(kong)的OD值(zhi)。

實驗(yan)結(jie)果計算

以(yi)所測標準品的OD值為橫(heng)坐標，標準品的濃度值為縱坐標(biao)，在(zai)坐標(biao)紙上或用(yong)相關(guan)軟件(jian)繪制(zhi)標準曲線，并得(de)到直線回歸方程，將樣品(pin)的OD值代入(ru)方(fang)程，計算出樣品(pin)的濃度。

試(shi)劑(ji)盒(he)性(xing)能

1、檢測(ce)范圍：3.75 pg/mL – 120 pg/mL。

2、靈敏度(du)：低檢測濃度(du)小于0.1 pg/mL。

3、特異(yi)性：不(bu)與其它可溶性結構類似物交叉(cha)反應。

4、重(zhong)復性：板(ban)內變異系數小于10% ，板(ban)間變(bian)異系數小于15% 。